| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 中英文缩写对照表 | 第15-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-29页 |
| 1.1 生物催化制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯 | 第16-22页 |
| 1.1.1 (3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的重要用途 | 第16-17页 |
| 1.1.2 (3R,5S)-CDHH的制备方法 | 第17-19页 |
| 1.1.3 采用路径2不对称合成(3R,5S)-CDHH的研究进展 | 第19-22页 |
| 1.2 脱氢酶催化羰基不对称还原的机制 | 第22-23页 |
| 1.3 不对称还原过程中的辅酶原位再生 | 第23-25页 |
| 1.3.1 底物偶联法(Substrate-coupled method) | 第23-24页 |
| 1.3.2 酶偶联法(Enzyme-coupled method) | 第24-25页 |
| 1.4 面向工业应用的羰基还原酶酶分子改造 | 第25-27页 |
| 1.5 本论文的研究思路及研究内容 | 第27-29页 |
| 第二章 材料与方法 | 第29-56页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-32页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第29-30页 |
| 2.1.2 主要实验仪器及设备 | 第30-31页 |
| 2.1.3 主要药品与试剂 | 第31-32页 |
| 2.2 实验方法 | 第32-44页 |
| 2.2.1 培养基 | 第32-33页 |
| 2.2.2 试剂配制 | 第33-35页 |
| 2.2.3 菌种的保藏及活化 | 第35-36页 |
| 2.2.4 基因相关操作方法 | 第36-38页 |
| 2.2.5 工程菌的诱导表达 | 第38页 |
| 2.2.6 重组菌体收集与细胞破碎 | 第38-39页 |
| 2.2.7 蛋白质SDS-PAGE电泳 | 第39页 |
| 2.2.8 蛋白的纯化 | 第39-40页 |
| 2.2.9 底物及手性产物衍生物的合成 | 第40-43页 |
| 2.2.10 化合物的表征 | 第43-44页 |
| 2.3 分析方法 | 第44-48页 |
| 2.3.1 CDOH不对称还原合成(S)-CHOH过程的定量分析方法的建立 | 第44-45页 |
| 2.3.2 (S)-CHOH的手性分析方法的建立 | 第45页 |
| 2.3.3 催化(S)-CHOH不对称还原合成(3R,5S)-CDHH过程的定量及手性分析方法的建立 | 第45-46页 |
| 2.3.4 酶活测定方法 | 第46-48页 |
| 2.3.5 蛋白质浓度的测定 | 第48页 |
| 2.3.6 生物量的测定 | 第48页 |
| 2.4 生物催化反应过程研究方法 | 第48-56页 |
| 2.4.1 生物催化不对称还原CDOH合成(S)-CHOH | 第48-52页 |
| 2.4.2 模拟方法 | 第52-53页 |
| 2.4.3 生物催化不对称还原(S)-CHOH合成(3R,5S)-CDHH | 第53-56页 |
| 第三章 酶法不对称还原催化剂的筛选 | 第56-66页 |
| 3.1 引言 | 第56页 |
| 3.2 催化CDOH不对称还原的氧化还原酶的筛选 | 第56-60页 |
| 3.2.1 LbADH基因的克隆 | 第57页 |
| 3.2.2 醇脱氢酶LkADH,LbADH,LkTADH的表达纯化与酶活分析 | 第57-59页 |
| 3.2.3 单批次全细胞催化CDOH不对称还原的过程比较 | 第59-60页 |
| 3.3 催化(S)-CHOH不对称还原的氧化还原酶的筛选 | 第60-65页 |
| 3.3.1 羰基还原酶CR,YDL及葡萄糖脱氢酶GDHBm-1的克隆 | 第60-61页 |
| 3.3.2 羰基还原酶CR,YDL,Dkr的表达纯化与酶活分析 | 第61-63页 |
| 3.3.3 双菌双酶法催化(S)-CHOH不对称还原过程的比较 | 第63-65页 |
| 3.4 本章小结 | 第65-66页 |
| 第四章 LkTADH全细胞不对称合成(S)-CHOH | 第66-80页 |
| 4.1 引言 | 第66页 |
| 4.2 LkTADH的酶学性质研究及底物CDOH的稳定性研究 | 第66-71页 |
| 4.2.1 LkTADH的最适pH和pH稳定性及pH对底物稳定性的影响 | 第66-67页 |
| 4.2.2 LkTADH的最适温度和温度稳定性及温度对底物稳定性的影响 | 第67-68页 |
| 4.2.3 镁离子和EDTA对LkTADH的影响 | 第68-69页 |
| 4.2.4 LkTADH的反应动力学研究及底物的副反应动力学研究 | 第69-71页 |
| 4.3 影响LkTADH全细胞催化CDOH不对称还原的因素考察 | 第71-73页 |
| 4.3.1 底物和产物浓度对LkTADH全细胞转化效率的影响 | 第71-72页 |
| 4.3.2 异丙醇和丙酮浓度对LkTADH全细胞转化效率的影响 | 第72页 |
| 4.3.3 辅酶浓度对LkTADH全细胞转化效率的影响 | 第72-73页 |
| 4.4 分批补料提高底物浓度的研究 | 第73-77页 |
| 4.5 物质的结构表征 | 第77-79页 |
| 4.6 本章小结 | 第79-80页 |
| 第五章 LkTADH的构效关系研究及分子改造 | 第80-98页 |
| 5.1 引言 | 第80页 |
| 5.2 同源建模 | 第80-83页 |
| 5.3 LkADH和LkTADH的结构特征分析 | 第83-85页 |
| 5.4 分子对接与催化机理研究 | 第85-87页 |
| 5.5 LkTADH的回复突变研究 | 第87-93页 |
| 5.5.1 回复突变体的构建 | 第87-88页 |
| 5.5.2 回复突变体的酶活分析 | 第88-90页 |
| 5.5.3 反应动力学研究 | 第90-93页 |
| 5.6 LkADH与M_(147)的底物谱研究 | 第93-94页 |
| 5.7 关于LkTADH突变位点的作用机理解析 | 第94-96页 |
| 5.8 采用突变体M_(147-202)全细胞催化CDOH不对称还原的工艺放大 | 第96-97页 |
| 5.9 本章小结 | 第97-98页 |
| 第六章 CR-GDH共表达菌株不对称合成(3R,5S)-CDHH | 第98-118页 |
| 6.1 引言 | 第98页 |
| 6.2 CR的酶学性质研究 | 第98-101页 |
| 6.2.1 CR的最适pH及pH稳定性 | 第99页 |
| 6.2.2 CR的最适温度及温度稳定性 | 第99页 |
| 6.2.3 CR的动力学参数测定 | 第99-101页 |
| 6.3 葡萄糖脱氢酶的热稳定性改造 | 第101-104页 |
| 6.3.1 野生酶GDHBm-1及GDHBm-2的热稳定性 | 第101页 |
| 6.3.2 定点突变提高GDHBm-2的热稳定性 | 第101-104页 |
| 6.4 CR与GDH-Q高效辅酶再生系统的构建 | 第104-107页 |
| 6.4.1 CR与GDH-Q单菌共表达体系的构建 | 第104-106页 |
| 6.4.2 单菌共表达体系与其他双酶耦合方式的比较 | 第106-107页 |
| 6.5 底物(S)-CHOH和产物(3R,5S)-CDHH的稳定性研究 | 第107-109页 |
| 6.6 CR-GDH-Q共表达菌株不对称合成(3R,5S)-CDHH的研究 | 第109-117页 |
| 6.6.1 (S)-CHOH和(3R,5S)-CDHH对CR酶活的影响 | 第109-110页 |
| 6.6.2 (S)-CHOH和(3R,5S)-CDHH对CR和GDH-Q稳定性的影响 | 第110-111页 |
| 6.6.3 反应体系中葡萄糖浓度对反应的影响 | 第111页 |
| 6.6.4 反应体系中pH对反应的影响 | 第111-112页 |
| 6.6.5 反应体系的温度对反应的影响 | 第112-113页 |
| 6.6.6 利用自动控制pH反应装置不对称合成(3R,5S)-CDHH | 第113-116页 |
| 6.6.7 产物(3R,5S)-CDHH的后处理及表征 | 第116-117页 |
| 6.7 本章小结 | 第117-118页 |
| 第七章 结论与展望 | 第118-120页 |
| 7.1 结论 | 第118-119页 |
| 7.2 展望 | 第119-120页 |
| 参考文献 | 第120-127页 |
| 附录A 本研究涉及的基因序列 | 第127-130页 |
| 附录B 引物列表 | 第130-131页 |
| 附录C 质粒图谱 | 第131-134页 |
| 附录D 质谱图 | 第134-136页 |
| 附录E 核磁共振谱图 | 第136-141页 |
| 附录F 产品手性测定HPLC图 | 第141-142页 |
| 作者简介 | 第142页 |
