| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 绪论 | 第13-22页 |
| 1.1 引言 | 第13页 |
| 1.2 筛选催化还原COBE至(R)-CHBE的微生物 | 第13-14页 |
| 1.3 基因克隆、表达以及在用于生产(R)-CHBE的宿主菌中的鉴定 | 第14-18页 |
| 1.4 辅酶再生系统的构建 | 第18页 |
| 1.5 重组菌生物催化COBE生成(R)-CHBE | 第18-20页 |
| 1.6 课题研究背景、意义与主要内容 | 第20-22页 |
| 1.6.1 研究背景和意义 | 第20页 |
| 1.6.2 课题主要研究内容 | 第20-22页 |
| 第2章 KR的克隆、鉴定及表达 | 第22-35页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 实验材料与试剂 | 第22-24页 |
| 2.2.1 菌种和质粒 | 第22页 |
| 2.2.2 试剂及仪器 | 第22-24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-30页 |
| 2.3.1 KR在酵母菌中的克隆和表达 | 第24-27页 |
| 2.3.1.1 目的基因连接克隆载体 | 第25页 |
| 2.3.1.2 KR-P克隆载体的转化 | 第25页 |
| 2.3.1.3 筛选KR-P转化子 | 第25-26页 |
| 2.3.1.4 抽提重组质粒 | 第26-27页 |
| 2.3.2 KR表达菌株的构建 | 第27-29页 |
| 2.3.2.1 酵母电转化 | 第27-28页 |
| 2.3.2.2 KR表达质粒的构建 | 第28-29页 |
| 2.3.3 KR的异源表达与纯化 | 第29页 |
| 2.3.3.1 表达产物的鉴定 | 第29页 |
| 2.3.4 KR的酶学性质研究 | 第29-30页 |
| 2.3.4.1 KR酶的纯化 | 第29页 |
| 2.3.4.2 KR酶的活性测定 | 第29-30页 |
| 2.3.4.3 KR酶的最适反应温度的测定 | 第30页 |
| 2.3.4.4 KR酶的最适反应pH的测定 | 第30页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第30-35页 |
| 2.4.1 总RNA的制备 | 第30-31页 |
| 2.4.1.1 TRIzol法提取总RNA | 第30页 |
| 2.4.1.2 DNaseⅠ处理 | 第30-31页 |
| 2.4.2 酮基还原酶基因（KR）的克隆及表达菌株的构建 | 第31页 |
| 2.4.3 重组质粒的构建和转化 | 第31-32页 |
| 2.4.4 GS115-KRGDH诱导表达 | 第32-33页 |
| 2.4.5 KR酶的最适反应温度 | 第33-34页 |
| 2.4.6 KR酶的最适反应pH | 第34-35页 |
| 第3章 KR酶催化不对称还原反应 | 第35-43页 |
| 3.1 引言 | 第35页 |
| 3.2 试剂与仪器 | 第35-36页 |
| 3.3 实验方法 | 第36-38页 |
| 3.3.1 酮基还原酶（KR）进行催化反应 | 第36-37页 |
| 3.3.1.1 工程菌种GS115-KRGDH | 第36页 |
| 3.3.1.2 培养基-YPD | 第36页 |
| 3.3.1.3 培养 | 第36页 |
| 3.3.1.4 转化实验 | 第36-37页 |
| 3.3.2 高效液相色谱法（HPLC）检测反应产物 | 第37-38页 |
| 3.3.2.1 高效液相色谱（HPLC）的检测方法 | 第37页 |
| 3.3.2.2 高效液相色谱(HPLC)数据处理方法 | 第37-38页 |
| 3.3.2.3 KR酶的活性测定及活力定义 | 第38页 |
| 3.3.2.4 KR酶的对应体过量值测定 | 第38页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第38-43页 |
| 3.4.1 原料COBE和产物(R)-CHBE的标准品HPLC分析 | 第38-40页 |
| 3.4.2 COBE浓度对酶催化还原反应的影响 | 第40页 |
| 3.4.3 反应时间对酶催化还原反应的影响 | 第40-43页 |
| 第4章 辅酶再生系统优化制备(R)-CHBE | 第43-52页 |
| 4.1 引言 | 第43页 |
| 4.2 材料及试剂 | 第43-44页 |
| 4.2.1 菌种及质粒 | 第43页 |
| 4.2.2 试剂和仪器 | 第43-44页 |
| 4.3 实验方法 | 第44-46页 |
| 4.3.1 GDH基因克隆 | 第44-45页 |
| 4.3.1.1 引物设计和合成 | 第44页 |
| 4.3.1.2 方法 | 第44-45页 |
| 4.3.2 GDH转化GS115的方法与KR转化GS115时相同 | 第45页 |
| 4.3.3 葡萄糖脱氢酶（GDH酶）酶活测定 | 第45页 |
| 4.3.4 KR酶和GDH酶共表达催化反应制备(R)-CHBE | 第45-46页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第46-52页 |
| 4.4.1 GDH基因克隆及表达载体构建 | 第46页 |
| 4.4.2 pETDUET-KRGDH表达载体构建 | 第46-48页 |
| 4.4.3 起始COBE浓度对催化反应的影响 | 第48-49页 |
| 4.4.4 反应时间对双酶催化反应的影响 | 第49-52页 |
| 第5章 结论与讨论 | 第52-54页 |
| 5.1 结论 | 第52页 |
| 5.2 讨论 | 第52-54页 |
| 参考文献 | 第54-61页 |
| 致谢 | 第61页 |
