| 摘要 | 第3-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 家蚕文献综述 | 第12-18页 |
| 1.1 丝绸行业现状 | 第12-13页 |
| 1.2 蚕桑业现状 | 第13-14页 |
| 1.3 家蚕生物反应器研究进展和面临的瓶颈 | 第14-15页 |
| 1.4 对家蚕驯化基因研究的必要性和有利条件 | 第15页 |
| 1.5 CRISPR/Cas9基因编辑技术的快速发展 | 第15-16页 |
| 1.6 应用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除的备选基因 | 第16-18页 |
| 第二章 敲除丝素重链探究丝胶茧形成机制 | 第18-50页 |
| 2.1 前言 | 第18-19页 |
| 2.2 材料与方法 | 第19-28页 |
| 2.2.1 CRISPR/Cas9敲除的方法及突变体的获得 | 第19-24页 |
| 2.2.2 突变体转录组分析 | 第24-28页 |
| 2.3 结果分析 | 第28-47页 |
| 2.3.1 丝素重链基因阅读框移码突变突变体获得 | 第28-33页 |
| 2.3.2 转录组分析 | 第33-47页 |
| 2.4 讨论 | 第47-50页 |
| 第三章 利用CRISPR/Cas9敲除家蚕存储蛋白1基因揭示其在蚕卵孵化中的重要作用 | 第50-64页 |
| 3.1 前言 | 第50-51页 |
| 3.2 材料与方法 | 第51-57页 |
| 3.2.1 材料 | 第51页 |
| 3.2.2 构建部分鳞翅目昆虫储存蛋白进化树 | 第51-52页 |
| 3.2.3 sgRNA设计及合成 | 第52页 |
| 3.2.4 sgRNA体外转录 | 第52-53页 |
| 3.2.5 Cas9质粒线性化 | 第53-54页 |
| 2.2.6 Cas9 mRNA体外转录 | 第54页 |
| 2.2.7 显微注射实验前准备 | 第54页 |
| 2.2.8 注射卵的制备 | 第54页 |
| 3.2.9 显微注射预实验 | 第54-55页 |
| 3.2.10 显微注射 | 第55页 |
| 3.2.11 突变体筛选 | 第55页 |
| 3.2.12 纯合突变体编码蛋白预测 | 第55页 |
| 3.2.13 RNA提取 | 第55-56页 |
| 3.2.14 cDNA转录 | 第56-57页 |
| 3.2.15 qPCR分析 | 第57页 |
| 3.2.16 纯合突变体表型观察及统计 | 第57页 |
| 3.3 结果 | 第57-62页 |
| 3.3.1 确定BmSp1属于蛋氨酸富集储存蛋白 | 第57-59页 |
| 3.3.2 sgRNA位点设计和BmSp1突变类型 | 第59页 |
| 3.3.3 筛选纯合突变体和突变体编码蛋白预测 | 第59-60页 |
| 3.3.4 BmSp1基因在突变体脂肪体中表达情况 | 第60-61页 |
| 3.3.5 突变引起孵化率显著降低,但是不影响茧重和蛹重 | 第61-62页 |
| 3.4 讨论 | 第62-64页 |
| 第四章 P25以及驯化相关基因在多化地方品系nistari中的敲除以及后续分析 | 第64-80页 |
| 4.1 基因信息 | 第64-65页 |
| 4.2 材料与方法 | 第65-70页 |
| 4.2.1 材料 | 第65页 |
| 4.2.2 sgRNA设计及合成 | 第65-67页 |
| 4.2.3 sgRNA体外转录 | 第67-68页 |
| 4.2.4 Cas9质粒线性化 | 第68页 |
| 4.2.5 Cas9 mRNA体外转录 | 第68-69页 |
| 4.2.6 显微注射实验前准备 | 第69页 |
| 4.2.7 注射卵的制备 | 第69页 |
| 4.2.8 显微注射预实验 | 第69页 |
| 4.2.9 显微注射 | 第69-70页 |
| 4.2.10 突变体筛选 | 第70页 |
| 4.3 结果 | 第70-79页 |
| 4.3.1 敲除P25基因导致吐丝量减少,但是不影响正常吐丝 | 第70-72页 |
| 4.3.2 敲除锌指蛋白幼虫死亡率增加,蛹期呈现多态性 | 第72-74页 |
| 4.3.3 在驯化过程受到人工选择的氨基酸代谢通路相关基因敲除 | 第74-77页 |
| 4.3.4 节律基因的敲除 | 第77-79页 |
| 4.4 讨论 | 第79-80页 |
| 第五章 CRISPR/Cas9基因编辑技术在云南本地实用品系中的可行性探索 | 第80-90页 |
| 5.1 基因信息 | 第80页 |
| 5.2 材料与方法 | 第80-86页 |
| 5.2.1 材料 | 第80-81页 |
| 5.2.2 sgRNA设计及合成 | 第81-83页 |
| 5.2.3 sgRNA体外转录 | 第83-84页 |
| 5.2.4 Cas9质粒线性化 | 第84页 |
| 5.2.5 Cas9 mRNA体外转录 | 第84-85页 |
| 5.2.6 显微注射实验前准备 | 第85页 |
| 5.2.7 注射卵的制备 | 第85页 |
| 5.2.8 显微注射预实验 | 第85页 |
| 5.2.9 显微注射 | 第85页 |
| 5.2.10 突变体检测 | 第85-86页 |
| 5.3 结果 | 第86-88页 |
| 5.3.1 P25基因敲除后代滞育后目前没有孵化 | 第86-87页 |
| 5.3.2 BGIBMGA000612-TA, BGIBMGA000648-TA, BGIBMGA006831-TA6,BGIBMGA000601-TA突变检测 | 第87-88页 |
| 5.4 讨论 | 第88-90页 |
| 第六章 总结和展望 | 第90-92页 |
| 致谢 | 第92-95页 |
| 参考文献 | 第95-99页 |
| 附录A 攻读学位期间发表及待发表论文 | 第99-100页 |
| 附录B 攻读学位期间申请专利 | 第100页 |
