| 缩略语表 | 第9-13页 |
| 中文摘要 | 第13-18页 |
| Abstract | 第18-22页 |
| 前言 | 第23-26页 |
| 文献回顾 | 第26-53页 |
| 一、绝经后骨质疏松症的研究进展 | 第26-30页 |
| 1. 骨质疏松症的基本概念 | 第26页 |
| 2. 绝经后骨质疏松症的现状 | 第26-27页 |
| 3. 绝经后骨质疏松症与牙槽骨吸收 | 第27-28页 |
| 4. 治疗绝经后骨质疏松症患者牙槽骨吸收目前存在的难题 | 第28-30页 |
| 二、骨髓间充质干细胞 | 第30-39页 |
| 1. BMMSCs的多向分化潜能 | 第31-33页 |
| 1.1 成骨分化 | 第31-32页 |
| 1.2 成脂分化 | 第32页 |
| 1.3 向神经组织分化 | 第32-33页 |
| 1.4 成软骨分化 | 第33页 |
| 1.5 向肌组织分化 | 第33页 |
| 2. BMMSCs的分离方法与表型鉴定 | 第33-35页 |
| 3. BMMSCs与骨质疏松症 | 第35-36页 |
| 4. BMMSCs在骨组织修复和改建中的应用 | 第36-39页 |
| 三、1-磷酸鞘氨醇和FTY-720 | 第39-46页 |
| 1. S1P的代谢过程 | 第39-42页 |
| 2. S1P的生物学功能 | 第42-43页 |
| 3. S1P在维持骨代谢动态平衡中的作用 | 第43-44页 |
| 4. S1P可促进细胞的成骨分化 | 第44-45页 |
| 5. FTY-720是S1P的化学类似物 | 第45-46页 |
| 四、Smad信号通路与成骨分化 | 第46-48页 |
| 1. Smads蛋白家族成员 | 第46-47页 |
| 2. Smad信号通路的活化过程 | 第47页 |
| 3. Smad信号通路在成骨分化过程中的作用 | 第47-48页 |
| 五、以慢病毒为载体的RNA干扰技术 | 第48-51页 |
| 1. RNAi的发现 | 第48页 |
| 2. RNAi的作用机制 | 第48-50页 |
| 3. RNAi技术载体的选择 | 第50-51页 |
| 六、本课题的意义 | 第51-53页 |
| 第一部分 去势大鼠骨质疏松动物模型的建立 | 第53-60页 |
| 1 材料 | 第53-54页 |
| 1.1 实验动物 | 第53页 |
| 1.2 实验主要试剂 | 第53-54页 |
| 1.3 实验主要仪器 | 第54页 |
| 2 方法 | 第54-56页 |
| 2.1 建模方法 | 第54-55页 |
| 2.2 动物模型鉴定 | 第55-56页 |
| 3 结果 | 第56-58页 |
| 3.1 一般情况 | 第56页 |
| 3.2 建模后OVX组与SHAM组大鼠间体重的比较 | 第56-57页 |
| 3.3 建模后OVX组与SHAM组大鼠Micro-CT三维重建后形态学分析 | 第57-58页 |
| 3.4 建模后OVX组与SHAM组大鼠BMD、Tb.Th、BVF的测定结果 | 第58页 |
| 4 讨论 | 第58-60页 |
| 第二部分 不同浓度梯度FTY-720对rBMMSCs成骨分化的影响 | 第60-82页 |
| 1 材料 | 第60-62页 |
| 1.1 实验动物 | 第60-61页 |
| 1.2 实验主要试剂 | 第61-62页 |
| 1.3 实验主要仪器 | 第62页 |
| 2 方法 | 第62-72页 |
| 2.1 rBMMSCs的分离和培养 | 第62-64页 |
| 2.1.1 原代培养 | 第62-63页 |
| 2.1.2 传代培养 | 第63页 |
| 2.1.3 多向分化培养 | 第63-64页 |
| 2.2 rBMMSCs的表型鉴定 | 第64页 |
| 2.3 MTT法检测rBMMSCs增殖能力 | 第64-65页 |
| 2.4 不同浓度梯度FTY-720诱导rBMMSCs分组情况 | 第65页 |
| 2.5 不同浓度梯度FTY-720对rBMMSCs的成骨诱导 | 第65页 |
| 2.6 qRT-PCR检测rBMMSCs成骨相关标志物的表达 | 第65-69页 |
| 2.6.1 细胞总RNA的提取 | 第66-67页 |
| 2.6.2 总RNA反转录为cDNA | 第67页 |
| 2.6.3 Real-time PCR检测 | 第67-69页 |
| 2.7 Western blot检测成骨相关蛋白的表达 | 第69-72页 |
| 2.7.1 细胞总蛋白样本制备 | 第69页 |
| 2.7.2 全蛋白样本浓度测定 | 第69-70页 |
| 2.7.3 蛋白样本的处理 | 第70页 |
| 2.7.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第70-71页 |
| 2.7.5 转膜(PVDF膜湿转) | 第71页 |
| 2.7.6 封闭 | 第71页 |
| 2.7.7 一抗的孵育 | 第71-72页 |
| 2.7.8 抗的孵育 | 第72页 |
| 2.7.9 显影 | 第72页 |
| 2.8 统计学分析 | 第72页 |
| 3 结果 | 第72-79页 |
| 3.1 rBMMSCs形态学观察 | 第72-73页 |
| 3.2 茜素红S染色 | 第73-74页 |
| 3.3 油红O染色 | 第74页 |
| 3.4 rBMMSCs表面标记物鉴定 | 第74-76页 |
| 3.5 细胞生长曲线测定 | 第76页 |
| 3.6 FTY-720成骨诱导rBMMSCs后的形态学观察 | 第76-77页 |
| 3.7 qRT-PCR检测成骨相关基因表达 | 第77-78页 |
| 3.8 Western blot检测成骨相关蛋白表达含量 | 第78-79页 |
| 4 讨论 | 第79-82页 |
| 第三部分 慢病毒介导的Smad4基因沉默对FTY-720增强BMMSCs成骨能力的影响 | 第82-108页 |
| 1 材料 | 第83-85页 |
| 1.1 实验对象 | 第83页 |
| 1.2 实验主要试剂 | 第83-84页 |
| 1.3 实验主要仪器 | 第84-85页 |
| 1.4 主要试剂的配制 | 第85页 |
| 2 方法 | 第85-98页 |
| 2.1 针对Smad4基因的shRNA表达载体构建 | 第85-93页 |
| 2.1.1 感受态大肠杆菌的制备 | 第85-86页 |
| 2.1.2 siRNA序列的设计 | 第86-88页 |
| 2.1.3 双链DNA模板设计与单链DNA合成 | 第88页 |
| 2.1.4 单链DNA退火形成双链DNA | 第88-89页 |
| 2.1.5 对质粒表达载体(GV112)进行酶切线性化处理 | 第89-90页 |
| 2.1.6 shRNA与载体的连接 | 第90-91页 |
| 2.1.7 连接产物转化 | 第91页 |
| 2.1.8 阳性克隆的PCR鉴定 | 第91-92页 |
| 2.1.9 质粒提取 | 第92-93页 |
| 2.1.10 质粒酶切和测序鉴定 | 第93页 |
| 2.2 慢病毒干扰载体的包装和感染 | 第93-95页 |
| 2.2.1 HEK-293T细胞的培养和传代 | 第93页 |
| 2.2.2 HEK-293T细胞的转染 | 第93-94页 |
| 2.2.3 干扰效率评价 | 第94-95页 |
| 2.3 rBMMSCs-OVX稳转细胞株的构建 | 第95-97页 |
| 2.3.1 病毒纯化 | 第95页 |
| 2.3.2 病毒滴度的测定 | 第95-96页 |
| 2.3.3 病毒滴度的计算 | 第96页 |
| 2.3.4 慢病毒感染rBMMSCs-OVX | 第96-97页 |
| 2.3.5 qRT-PCR检测rBMMSCs-OVX细胞中Smad4基因的表达变化 | 第97页 |
| 2.3.6 Western blot检测rBMMSCs-OVX细胞中Smad4蛋白表达情况 | 第97页 |
| 2.4 Smad4基因靶向抑制对FTY-720促rBMMSCs-OVX成骨分化的影响 | 第97页 |
| 2.4.1 qRT-PCR检测成骨相关基因的表达 | 第97页 |
| 2.4.2 Western blot检测成骨相关蛋白的表达 | 第97页 |
| 2.5 统计学分析 | 第97-98页 |
| 3 结果 | 第98-106页 |
| 3.1 测序鉴定结果 | 第98-100页 |
| 3.2 HEK-293T细胞中Smad4基因干扰效率评价 | 第100-102页 |
| 3.2.1 qRT-PCR检测HEK-293T细胞中Smad4基因mRNA的表达 | 第100页 |
| 3.2.2 Western blot检测HEK-293T细胞内Smad4蛋白水平 | 第100-102页 |
| 3.3 rBMMSCs-OVX的稳转细胞株Smad4基因干扰效果 | 第102-103页 |
| 3.3.1 rBMMSCs-OVX的稳转细胞株Smad4的mRNA表达 | 第102页 |
| 3.3.2 稳转细胞株LV-S2-OVX的Smad4蛋白水平的表达 | 第102-103页 |
| 3.4 慢病毒介导的Smad4基因干扰对10 nM FTY-720促成骨作用的影响 | 第103-106页 |
| 3.4.1 Smad4基因干扰对10 nM FTY-720诱导rBMMSCs成骨相关基因mRNA表达水平的影响 | 第103-104页 |
| 3.4.2 Smad4基因干扰对10 nM FTY-720诱导rBMMSCs成骨相关蛋白表达的影响 | 第104-106页 |
| 4 讨论 | 第106-108页 |
| 第四部分 慢病毒介导的Smad4基因沉默对OVX大鼠颅骨缺损模型在FTY-720促成骨作用下愈合质量的影响 | 第108-113页 |
| 1 材料 | 第109-110页 |
| 1.1 实验动物与细胞 | 第109页 |
| 1.2 实验主要试剂 | 第109页 |
| 1.3 实验的主要仪器 | 第109-110页 |
| 2 方法 | 第110-111页 |
| 2.1 大鼠颅骨骨缺损模型建模方法 | 第110页 |
| 2.2 复合支架材料的植入及实验分组 | 第110页 |
| 2.3 Micro-CT扫描观察颅骨缺损修复情况 | 第110页 |
| 2.4 统计学分析 | 第110-111页 |
| 3 结果 | 第111页 |
| 3.1 Micro-CT扫描结果 | 第111页 |
| 4 讨论 | 第111-113页 |
| 全文总结 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-129页 |
| 个人简历和研究成果 | 第129-130页 |
| 致谢 | 第130页 |
