| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 引言 | 第13-23页 |
| 1.1 猪传染性胃肠炎病毒的形态学特征 | 第13-14页 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒基因组结构 | 第14页 |
| 1.3 猪传染性胃肠炎病毒的蛋白结构和功能 | 第14-17页 |
| 1.3.1 猪传染性胃肠炎病毒的非结构蛋白 | 第14-15页 |
| 1.3.2 猪传染性胃肠炎病毒的结构蛋白 | 第15-17页 |
| 1.4 猪传染性胃肠炎病毒的致病机制 | 第17页 |
| 1.5 猪传染性胃肠炎的诊断 | 第17-19页 |
| 1.5.1 猪传染性胃肠炎病毒分离鉴定 | 第18页 |
| 1.5.2 猪传染性胃肠炎的分子生物学诊断方法 | 第18页 |
| 1.5.3 猪传染性胃肠炎的血清学诊断方法 | 第18-19页 |
| 1.6 猪传染性胃肠炎疫苗的研究进展 | 第19-20页 |
| 1.6.1 传统疫苗 | 第19页 |
| 1.6.2 基因工程疫苗 | 第19-20页 |
| 1.7 乳酸菌作为活载体疫苗载体的优势 | 第20-21页 |
| 1.8 本课题研究的目的及意义 | 第21-23页 |
| 2 TGEV N基因的克隆及原核表达 | 第23-49页 |
| 2.1 材料 | 第23-28页 |
| 2.1.1 毒株与细胞 | 第23页 |
| 2.1.2 载体及菌株等 | 第23页 |
| 2.1.3 试验所用主要试剂 | 第23-25页 |
| 2.1.4 试验所用溶液及其配制 | 第25-27页 |
| 2.1.5 主要仪器 | 第27-28页 |
| 2.2 方法 | 第28-38页 |
| 2.2.1 PK-15细胞的复苏、培养及病毒的增值 | 第28页 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.3 N基因的克隆 | 第29-33页 |
| 2.2.4 N基因的原核重组表达载体的构建 | 第33-35页 |
| 2.2.5 重组蛋白的诱导表达及表达最佳条件的确定 | 第35-36页 |
| 2.2.6 重组蛋白的纯化 | 第36-37页 |
| 2.2.7 重组蛋白的Western-blotting鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2.8 蛋白质浓度的测定 | 第38页 |
| 2.3 结果 | 第38-47页 |
| 2.3.1 N基因的RT-PCR扩增结果 | 第38页 |
| 2.3.2 重组质粒pEASY-N的鉴定结果 | 第38-40页 |
| 2.3.3 重组表达质粒pCold Ⅱ-N的鉴定结果 | 第40-41页 |
| 2.3.4 重组蛋白的表达形式及表达条件的确定结果 | 第41-44页 |
| 2.3.5 重组蛋白的纯化结果 | 第44-45页 |
| 2.3.6 重组蛋白的Western-blotting鉴定结果 | 第45-46页 |
| 2.3.7 蛋白质浓度测定结果 | 第46-47页 |
| 2.4 讨论 | 第47-49页 |
| 2.4.1 TGEV N基因的扩增 | 第47页 |
| 2.4.2 表达系统的选择 | 第47-48页 |
| 2.4.3 目的蛋白的纯化 | 第48-49页 |
| 3 TGEV表达N蛋白间接ELISA方法的建立 | 第49-57页 |
| 3.1 材料 | 第49页 |
| 3.1.1 血清 | 第49页 |
| 3.1.2 ELISA所需主要试剂 | 第49页 |
| 3.1.3 ELISA所用溶液及配制 | 第49页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第49页 |
| 3.2 方法 | 第49-51页 |
| 3.2.1 重组蛋白最适包被浓度和最佳血清稀释度的确定 | 第49-50页 |
| 3.2.2 封闭液及抗体稀释液的确定 | 第50页 |
| 3.2.3 酶标二抗稀释浓度的确定 | 第50页 |
| 3.2.4 血清和酶标二抗最佳孵育时间的确定 | 第50页 |
| 3.2.5 间接ELISA阴阳性临界值的确定 | 第50-51页 |
| 3.2.6 特异性试验 | 第51页 |
| 3.2.7 重复性试验 | 第51页 |
| 3.2.8 符合性试验 | 第51页 |
| 3.3 结果 | 第51-56页 |
| 3.3.1 重组蛋白最适包被浓度和最佳血清稀释度 | 第51-52页 |
| 3.3.2 重组蛋白最佳封闭液及抗体稀释液 | 第52页 |
| 3.3.3 重组蛋白最佳酶标二抗稀释倍数 | 第52-53页 |
| 3.3.4 血清和酶标二抗最佳孵育时间的确定 | 第53页 |
| 3.3.5 ELISA阴阳性临界值确定 | 第53-54页 |
| 3.3.6 特异性试验 | 第54页 |
| 3.3.7 重复性试验 | 第54-55页 |
| 3.3.8 符合性试验 | 第55-56页 |
| 3.4 讨论 | 第56-57页 |
| 4 猪传染性胃肠炎病毒S1基因重组乳酸菌载体的构建及表达 | 第57-69页 |
| 4.1 材料 | 第57-58页 |
| 4.1.1 载体 | 第57页 |
| 4.1.2 载体构建及诱导表达所需主要试剂 | 第57页 |
| 4.1.3 载体构建及诱导表达用液及配制 | 第57-58页 |
| 4.1.4 主要仪器 | 第58页 |
| 4.2 方法 | 第58-64页 |
| 4.2.1 猪传染性胃肠炎病毒S1基因重组乳酸菌载体的构建 | 第58-63页 |
| 4.2.2 重组蛋白的诱导表达及表达产物的鉴定 | 第63-64页 |
| 4.3 结果 | 第64-67页 |
| 4.3.1 阳性克隆乳酸菌的鉴定结果 | 第64-65页 |
| 4.3.2 重组蛋白的诱导表达结果 | 第65-66页 |
| 4.3.3 重组蛋白的鉴定结果 | 第66-67页 |
| 4.4 讨论 | 第67-69页 |
| 4.4.1 乳酸菌表达系统 | 第67页 |
| 4.4.2 抗原的选择 | 第67-68页 |
| 4.4.3 TGEV S1基因的优化 | 第68页 |
| 4.4.4 TGEV S1蛋白在乳酸菌中的诱导表达 | 第68-69页 |
| 5 结论 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-79页 |
| 附录 | 第79-88页 |
| 作者简介 | 第88页 |
