| 致谢 | 第4-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 1 引言 | 第15-35页 |
| 1.1 双组分信号转导系统 | 第15-25页 |
| 1.1.1 双组分信号转导系统的基本机制 | 第15-16页 |
| 1.1.2 TCS系统蛋白质的结构特征 | 第16-21页 |
| 1.1.2.1 HK蛋白Sensor domain结构特征 | 第17页 |
| 1.1.2.2 HK蛋白HAMP domain结构特征 | 第17-18页 |
| 1.1.2.3 HK蛋白DHp domain结构特征 | 第18-19页 |
| 1.1.2.4 HK蛋白CA domain结构特征 | 第19-20页 |
| 1.1.2.5 RR蛋白的结构特征 | 第20-21页 |
| 1.1.2.5.1 RR中的Receiver domain的结构特征 | 第20-21页 |
| 1.1.2.5.2 RR中的Effector domain的结构特征 | 第21页 |
| 1.1.3 TCS中的磷酸转移机制 | 第21-25页 |
| 1.1.3.1 HK蛋白的自磷酸化 | 第21-22页 |
| 1.1.3.2 从HK到RR的磷酸转移过程 | 第22-23页 |
| 1.1.3.3 RR蛋白的去磷酸化机制 | 第23-25页 |
| 1.1.3.3.1 RR蛋白的自去磷酸化机制 | 第23-24页 |
| 1.1.3.3.2 辅助磷酸酶介导的RR去磷酸化机制 | 第24页 |
| 1.1.3.3.3 HK催化的RR去磷酸化机制 | 第24-25页 |
| 1.1.4 TCS系统蛋白质的相互作用 | 第25页 |
| 1.2 生物大分子核磁共振技术 | 第25-31页 |
| 1.2.1 核磁共振基本原理 | 第26-27页 |
| 1.2.2 核磁共振中的观测参数 | 第27-30页 |
| 1.2.2.1 化学位移 | 第27-28页 |
| 1.2.2.2 J耦合常数 | 第28页 |
| 1.2.2.3 弛豫时间 | 第28-29页 |
| 1.2.2.4 NOE | 第29-30页 |
| 1.2.2.5 残余偶极耦合常数 | 第30页 |
| 1.2.3 核磁共振解析生物大分子结构 | 第30-31页 |
| 1.3 生物大分子动态研究 | 第31-32页 |
| 1.4 X射线晶体衍射方法解析生物大分子结构 | 第32-34页 |
| 1.4.1 生物大分子结晶方法 | 第32-33页 |
| 1.4.2 X射线衍射结构解析步骤 | 第33-34页 |
| 1.5 研究的主要内容 | 第34-35页 |
| 2 磷酸基团类似物氟化铍探针 | 第35-47页 |
| 2.1 前言 | 第35-36页 |
| 2.2 材料与实验部分 | 第36-38页 |
| 2.2.1 样品制备和实验设计 | 第36-37页 |
| 2.2.2 核磁共振实验参数 | 第37页 |
| 2.2.3 动力学参数拟合方法 | 第37-38页 |
| 2.3 实验结果和讨论 | 第38-46页 |
| 2.3.1 氟化铍信号的归属 | 第38-39页 |
| 2.3.2 化学位移和信号强度分布规律 | 第39-41页 |
| 2.3.3 镁离子滴定实验 | 第41-44页 |
| 2.3.4 氟化铍产物交换速率 | 第44-45页 |
| 2.3.5 离子对模型 | 第45-46页 |
| 2.4 结论 | 第46-47页 |
| 3 应答调节蛋白的磷酸活化机制 | 第47-66页 |
| 3.1 前言 | 第47-48页 |
| 3.2 材料和实验部分 | 第48-51页 |
| 3.2.1 样品制备 | 第48-49页 |
| 3.2.2 主链归属实验 | 第49-50页 |
| 3.2.3 T_1、T_2、异核NOE实验 | 第50-51页 |
| 3.2.4 CPMG Relaxation Dispersion实验 | 第51页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第51-65页 |
| 3.3.1 RR468在溶液中的构象 | 第51-54页 |
| 3.3.2 快时间尺度动态研究 | 第54-56页 |
| 3.3.3 慢时间尺度动态研究 | 第56-59页 |
| 3.3.4 应用BeF_3~-获得稳定的类磷酸化态RR468 | 第59-60页 |
| 3.3.5 BeF_3~--RR468蛋白质动态研究 | 第60-61页 |
| 3.3.6 RR468的磷酸活化机制 | 第61-65页 |
| 3.4 结论 | 第65-66页 |
| 4 运用氟化铍探针研究应答调节蛋白的磷酸化态 | 第66-79页 |
| 4.1 前言 | 第66-67页 |
| 4.2 材料与实验部分 | 第67-68页 |
| 4.2.1 蛋白质的纯化和样品制备 | 第67页 |
| 4.2.2 核磁共振实验 | 第67-68页 |
| 4.2.2.1 ~(19)F NMR | 第67-68页 |
| 4.2.2.2 HISQC探测赖氨酸侧链以及信号归属 | 第68页 |
| 4.2.2.3 H3(N)F实验探测异核氢键耦合 | 第68页 |
| 4.3 结果和讨论 | 第68-77页 |
| 4.3.1 ~(19)F NMR探测磷酸化态RR468活性中心 | 第69-70页 |
| 4.3.2 NMR探测活性中心弱化学键 | 第70-77页 |
| 4.3.2.1 观测BeF_3~--T83氢键 | 第70-72页 |
| 4.3.2.2 间接观测BeF_3~--K105盐桥 | 第72-74页 |
| 4.3.2.3 直接观测BeF_3~--K105盐桥 | 第74-77页 |
| 4.4 结论 | 第77-79页 |
| 5 HisKA家族的催化去磷酸化机制与磷酸传递中的信号保护机制 | 第79-102页 |
| 5.1 前言 | 第79-81页 |
| 5.2 材料和实验部分 | 第81-87页 |
| 5.2.1 载体构建和基因定点突变 | 第81-83页 |
| 5.2.1.1 HK853胞内全长蛋白的质粒构建 | 第81-82页 |
| 5.2.1.2 DHp结构的构建 | 第82页 |
| 5.2.1.3 基因定点突变 | 第82-83页 |
| 5.2.2 蛋白质的表达纯化 | 第83-85页 |
| 5.2.2.1 HK853蛋白及其突变体的表达纯化 | 第84页 |
| 5.2.2.2 TEV酶以及RR468的表达纯化 | 第84-85页 |
| 5.2.2.3 DHp蛋白及其突变体的表达纯化 | 第85页 |
| 5.2.3 核磁共振实验 | 第85-87页 |
| 5.2.4 蛋白质共结晶与X射线衍射实验 | 第87页 |
| 5.2.5 RR468磷酸化与酶活性实验 | 第87页 |
| 5.2.6 Native Page和Phos-tag Page实验 | 第87页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第87-100页 |
| 5.3.1 BeF_3~-探针探测DHp-BeF_3~--RR468形成的复合体构象 | 第88页 |
| 5.3.2 复合物DHp-BeF_3~--RR468存在动态构象交换 | 第88-89页 |
| 5.3.3 探究蛋白质活性位点相互作用 | 第89-91页 |
| 5.3.4 T264扰动BeF_3~--RR468活性中心的盐桥 | 第91-92页 |
| 5.3.5 H260活化水有利于亲核攻击的进行 | 第92页 |
| 5.3.6 蛋白质复合体的晶体结构 | 第92-96页 |
| 5.3.7 HisKA家族催化去磷酸化机制 | 第96-100页 |
| 5.3.8 双组分系统中的信号保护机制 | 第100页 |
| 5.4 结论 | 第100-102页 |
| 6 总结与展望 | 第102-108页 |
| 6.1 结构和功能的联系 | 第102-103页 |
| 6.2 结构和动态的联系 | 第103-104页 |
| 6.3 动态和功能的联系 | 第104-106页 |
| 6.4 信号保护机制的意义 | 第106-107页 |
| 6.5 展望 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-126页 |
| 附录A：(H)CCNH脉冲序列 | 第126-136页 |
| 附录B：H3(N)F序列 | 第136-141页 |
| 附录C：晶体衍射数据 | 第141-143页 |
| 附录D：缩略表 | 第143-145页 |
| 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第145-146页 |
