| 摘要 | 第1-15页 |
| ABSTRACT | 第15-22页 |
| 缩写说明 | 第22-26页 |
| 前言 | 第26-38页 |
| 1 LKB1基因的基本特征 | 第26-27页 |
| ·LKB1基因的克隆 | 第26页 |
| ·LKB1基因的基本结构与表达分布 | 第26-27页 |
| 2 LKB1的生物学功能 | 第27-31页 |
| ·LKB1与细胞极性 | 第28-29页 |
| ·LKB1与能量代谢 | 第29-30页 |
| ·LKB1与细胞生长 | 第30-31页 |
| 3 LKB1与肿瘤发生 | 第31-32页 |
| 4 LKB1相关动物模型 | 第32-34页 |
| 5 条件性基因敲除技术 | 第34-38页 |
| ·条件性基因敲除技术简介 | 第34-35页 |
| ·Cre/LoxP位点重组酶系统的重组机制 | 第35-36页 |
| ·本论文中利用Cre-LoxP重组酶系统制作LKB1条件敲除小鼠 | 第36-38页 |
| 第一部分 Lkb1基因在小鼠内耳毛细胞发育中的功能研究 | 第38-94页 |
| 研究背景 | 第38-46页 |
| 1 听力的发生 | 第38-39页 |
| 2 耳的基本结构与功能 | 第39-40页 |
| 3 耳蜗的基本结构与功能 | 第40-41页 |
| 4 耳蜗毛细胞听纤毛的基本结构与平面细胞极性 | 第41-42页 |
| 5 小鼠的内耳耳蜗的发育 | 第42-44页 |
| ·听泡发育期(E8-E12) | 第42-43页 |
| ·蜗管上皮增殖期(E13-E14) | 第43页 |
| ·耳蜗各部分的分化期和发育成熟期(E14-P14) | 第43-44页 |
| 6 Lkb1基因在耳蜗毛细胞中的研究目的和立题意义 | 第44-46页 |
| 实验材料和主要仪器 | 第46-52页 |
| 1 实验动物 | 第46页 |
| 2 实验所需试剂 | 第46-50页 |
| ·主要试剂及其配制方法 | 第46-49页 |
| ·其他试剂 | 第49-50页 |
| 3 主要仪器设备 | 第50-52页 |
| 实验方法 | 第52-63页 |
| 1 LKB1组织特异性敲除小鼠的获得 | 第52页 |
| 2 耳蜗解剖及初步处理 | 第52页 |
| 3 鼠尾基因组的提取 | 第52-53页 |
| 4 实验小鼠基因型的鉴定 | 第53-54页 |
| 5 小鼠耳蜗石蜡切片 | 第54-55页 |
| 6 苏木精-伊红染色(HE染色) | 第55-56页 |
| 7 小鼠耳蜗冰冻切片 | 第56页 |
| 8 耳蜗基底膜铺片染色 | 第56-57页 |
| 9 耳蜗冰冻切片免疫荧光染色 | 第57-58页 |
| 10 耳蜗蛋白提取以及蛋白印记法(Western blot)检测 | 第58-59页 |
| 11 RNA提取以及Real-Time PCR(RT-PCR)检测 | 第59-61页 |
| ·小鼠耳蜗RNA提取 | 第59-60页 |
| ·RNA中去除DNA | 第60页 |
| ·RNA反转录出cDNA | 第60页 |
| ·RT-PCR从mRNA水平检测基因表达水平 | 第60-61页 |
| 12 小鼠测听(ABR和DPOAE) | 第61页 |
| 13 扫描电镜 | 第61-63页 |
| 实验结果 | 第63-85页 |
| 1 小鼠耳蜗毛细胞中LKB1的表达模式 | 第63-64页 |
| 2 制作由Pax2-Cre介导的耳蜗特异性敲除的小鼠 | 第64-65页 |
| ·Pax2-LKB1耳蜗特异性敲除的小鼠获得及鉴定 | 第64-65页 |
| ·耳蜗特异性敲除的小鼠中LKB1蛋白的表达验证 | 第65页 |
| 3 Pax2-LKB1条件敲除的小鼠个体形态发育及内耳发育异常 | 第65-66页 |
| 4 Pax2-LKB1条件敲除的小鼠内耳毛细胞检测 | 第66-69页 |
| ·Pax2-LKB1条件敲除的小鼠内耳毛细胞排列异常 | 第66-67页 |
| ·Pax2-LKB1条件敲除的小鼠内耳毛细胞静纤毛形态及朝向异常 | 第67-69页 |
| 5 Pax2-LKB1条件敲除的小鼠内耳毛细胞动纤毛定位异常 | 第69-71页 |
| 6 Atoh1-LKB1条件敲除小鼠鉴定 | 第71-72页 |
| ·Atoh1-LKB1耳蜗特异性敲除的小鼠获得及PCR鉴定 | 第71-72页 |
| ·耳蜗特异性敲除的小鼠中LKB1蛋白的表达验证 | 第72页 |
| 7 Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠整体形态发育异常 | 第72-73页 |
| 8 Atoh1-LKB1条件敲除小鼠的听力检测 | 第73-76页 |
| ·听性脑干反应(ABR)检测 | 第73页 |
| ·耳声发射反应(DPOAE)检测 | 第73-76页 |
| 9 Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠内耳耳蜗形态观察 | 第76页 |
| 10 Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠内耳毛细胞异常 | 第76-79页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠内毛细胞静纤毛轻微异常 | 第76-77页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠外毛细胞静纤毛形态明显异常 | 第77页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠内耳毛细胞表皮板异常 | 第77页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠内耳外毛细胞和柱细胞出现缺失 | 第77-79页 |
| 11 ERM蛋白家族水平检测 | 第79-81页 |
| ·ERM蛋白在小鼠内耳毛细胞中的表达定位 | 第79-80页 |
| ·ERM与p-ERM蛋白水平检测 | 第80-81页 |
| 12 Mst4蛋白家族水平检测 | 第81-85页 |
| ·Mst4蛋白在小鼠内耳毛细胞中的表达定位 | 第81-84页 |
| ·不同时期Mst4蛋白水平检测 | 第84-85页 |
| 讨论 | 第85-92页 |
| 结论 | 第92-93页 |
| 创新点 | 第93-94页 |
| 第二部分 Lkb1基因在小鼠小脑发育中的功能的研究 | 第94-140页 |
| 研究背景 | 第94-104页 |
| 1 小脑的结构 | 第94-95页 |
| 2 小脑的发育和成熟 | 第95-97页 |
| ·小脑的发生 | 第95-96页 |
| ·颗粒细胞和浦肯野细胞的发育成熟 | 第96-97页 |
| 3 小脑的功能 | 第97-98页 |
| 4 Lkb1基因在神经系统中的小鼠模型 | 第98-99页 |
| 5 Shh信号与小脑脑叶形成 | 第99-101页 |
| 6 小脑与人类疾病 | 第101-103页 |
| 7 Lkb1基因在小脑发育中的研究目的和立题意义 | 第103-104页 |
| 实验材料和主要仪器 | 第104-106页 |
| 1 实验动物 | 第104页 |
| 2 实验所需试剂 | 第104-105页 |
| ·主要试剂及其配制方法 | 第104-105页 |
| ·其他试剂 | 第105页 |
| 3 主要仪器 | 第105-106页 |
| 实验方法 | 第106-112页 |
| 1 LKB1组织特异性敲除小鼠的获得 | 第106页 |
| 2 小脑解剖 | 第106页 |
| 3 鼠尾基因组的提取与基因型的鉴定 | 第106页 |
| 4 小鼠小脑石蜡切片 | 第106-107页 |
| 5 小鼠小脑冰冻切片 | 第107-108页 |
| 6 小脑冰冻切片免疫荧光染色 | 第108页 |
| 7 小脑蛋白提取以及蛋白印记法(Western blot)检测 | 第108-109页 |
| 8 BrdU检测 | 第109-110页 |
| 9 细胞增殖和迁移的检测 | 第110页 |
| 10 小脑颗粒细胞的原代培养 | 第110-111页 |
| 11 体外颗粒细胞的增殖检测试验 | 第111页 |
| 12 小鼠行为学检测 | 第111-112页 |
| 实验结果 | 第112-132页 |
| 1 小鼠小脑中LKB1的表达模式 | 第112页 |
| 2 Atoh1-LKB1条件敲除小鼠的鉴定 | 第112-114页 |
| ·小脑特异性敲除的小鼠获得及PCR鉴定 | 第112页 |
| ·小脑特异性敲除的小鼠中LKB1蛋白的表达及验证 | 第112-114页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠的免疫荧光染色检测 | 第114页 |
| 3 Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠个体形态差异 | 第114页 |
| 4 Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠行为学异常 | 第114-116页 |
| ·步幅宽度检测 | 第115-116页 |
| ·滚筒实验检测 | 第116页 |
| ·悬挂试验检测 | 第116页 |
| 5 Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑发育异常 | 第116-119页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑整体形态发育异常 | 第116-117页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑蚓体发育明显异常 | 第117页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑分子层细胞数目明显增多 | 第117-119页 |
| 6 Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑异常表型的细胞水平分析 | 第119-122页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑中颗粒细胞数目明显增多 | 第120页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑中浦肯野细胞发育异常 | 第120-121页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑中神经胶质细胞未见异常 | 第121-122页 |
| 7 Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑中颗粒细胞祖细胞出现异常 | 第122-124页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑中细胞增殖加快 | 第123-124页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑中细胞凋亡未见明显异常 | 第124页 |
| 8 Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑中颗粒细胞迁移出现异常 | 第124-126页 |
| 9 Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑中单极性刷状细胞发育异常 | 第126-127页 |
| 10 Shh信号通路的Gli1、Gli2和Gli3的mRNA和蛋白水平检测 | 第127-129页 |
| 11 体外水平分析Shh信号对小鼠小脑中颗粒细胞祖细胞的增殖的影响 | 第129-130页 |
| 12 Atoh1-LKB1条件敲除的小鼠小脑的细胞周期检测 | 第130-131页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除小鼠小脑中CyclinD1表达的免疫荧光检测 | 第130-131页 |
| ·Atoh1-LKB1条件敲除小鼠小脑中CyclinD1的蛋白水平检测 | 第131页 |
| 13 AMPK蛋白水平检测 | 第131-132页 |
| 讨论 | 第132-138页 |
| 结论 | 第138-139页 |
| 创新点 | 第139-140页 |
| 参考文献 | 第140-158页 |
| 攻读博士研究生期间发表的主要学术论文情况 | 第158-160页 |
| 致谢 | 第160-162页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第162页 |
