| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 英文缩略词表 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-23页 |
| ·植物油脂的现状 | 第13-14页 |
| ·产油微生物的种类 | 第14-16页 |
| ·酵母菌和霉菌 | 第15页 |
| ·藻类 | 第15页 |
| ·细菌 | 第15-16页 |
| ·生物油脂代谢的途径和进展 | 第16-17页 |
| ·ATP-柠檬酸裂解酶的作用机制 | 第17-18页 |
| ·ATP-柠檬酸裂解酶的研究进展 | 第18-20页 |
| ·基因表达系统 | 第20-22页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第20-21页 |
| ·酵母表达系统 | 第21-22页 |
| ·本课题研究意义 | 第22-23页 |
| 第二章 不同真菌来源acl基因的克隆 | 第23-47页 |
| ·前言 | 第23页 |
| ·实验材料 | 第23-27页 |
| ·主要仪器设备 | 第23-24页 |
| ·菌株和质粒 | 第24页 |
| ·主要试剂 | 第24页 |
| ·主要试剂溶液的配制 | 第24-26页 |
| ·培养基及相关试剂 | 第24-25页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳相关试剂 | 第25页 |
| ·质粒提取及相关溶液 | 第25-26页 |
| ·所需引物 | 第26-27页 |
| ·实验方法 | 第27-35页 |
| ·粘红酵母和斯达酵母中acl基因的克隆 | 第27-32页 |
| ·DNA和RNA的提取 | 第27页 |
| ·简并引物的设计 | 第27页 |
| ·acl基因保守区的扩增 | 第27-29页 |
| ·大肠杆菌E.coli DH5α感受态的制备 | 第29-30页 |
| ·转化 | 第30页 |
| ·阳性克隆子的筛选 | 第30页 |
| ·基因组步移法扩增acl基因全长 | 第30-32页 |
| ·RT-PCR扩增acl基因全长 | 第32页 |
| ·高山被孢霉、米曲霉和核盘菌acl基因的克隆 | 第32-35页 |
| ·DNA的提取 | 第32页 |
| ·引物设计 | 第32页 |
| ·acl基因的扩增 | 第32-35页 |
| ·序列测序 | 第35页 |
| ·实验结果 | 第35-44页 |
| ·DNA和RNA的提取 | 第35-36页 |
| ·粘红酵母和斯达酵母acl基因的克隆 | 第36-43页 |
| ·acl基因保守区的扩增 | 第36-37页 |
| ·基因组步移法扩增结果 | 第37-39页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第39-40页 |
| ·序列分析 | 第40-43页 |
| ·高山被孢霉、米曲霉和核盘菌acl基因的克隆 | 第43-44页 |
| ·讨论 | 第44-45页 |
| ·真菌DNA的提取 | 第44页 |
| ·利用CODEHOP方法设计简并引物 | 第44-45页 |
| ·acl基因序列的分析 | 第45页 |
| ·本章小结 | 第45-47页 |
| 第三章 不同真菌来源acl基因在大肠杆菌中的表达 | 第47-70页 |
| ·前言 | 第47页 |
| ·实验材料 | 第47-50页 |
| ·主要仪器设备 | 第47-48页 |
| ·菌株和质粒 | 第48页 |
| ·主要试剂 | 第48页 |
| ·主要试剂溶液的配制 | 第48-50页 |
| ·蛋白纯化缓冲液 | 第48-49页 |
| ·Tris-cine系统电泳缓冲液 | 第49页 |
| ·脂肪酸分析试剂 | 第49-50页 |
| ·所需引物 | 第50页 |
| ·实验方法 | 第50-56页 |
| ·不同真菌来源acl基因在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中的表达 | 第50-55页 |
| ·引物设计 | 第50页 |
| ·acl1和acl2基因的扩增 | 第50-51页 |
| ·限制性内切酶消化DNA片段和表达质粒 | 第51-52页 |
| ·DNA片段的连接 | 第52页 |
| ·转化大肠杆菌DH5α | 第52页 |
| ·阳性克隆子的筛选 | 第52页 |
| ·重组质粒的抽提和酶切鉴定 | 第52-53页 |
| ·表达宿主菌的转化和目的蛋白的诱导表达 | 第53页 |
| ·ACL蛋白的纯化 | 第53-54页 |
| ·ACL蛋白酶活测定 | 第54-55页 |
| ·粘红酵母acl1和acl2基因在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中的共表达 | 第55-56页 |
| ·引物设计 | 第55页 |
| ·重组质粒构建 | 第55页 |
| ·重组质粒的大量提取 | 第55页 |
| ·表达宿主菌的转化和目的蛋白的诱导表达 | 第55页 |
| ·重组菌株脂肪酸含量的测定 | 第55-56页 |
| ·实验结果 | 第56-66页 |
| ·不同真菌来源acl基因在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中的表达 | 第56-63页 |
| ·重组载体构建图谱 | 第56-58页 |
| ·重组载体验证 | 第58-59页 |
| ·ACL1和ACL2诱导表达条件的优化 | 第59-60页 |
| ·ACL蛋白的纯化 | 第60-61页 |
| ·ACL蛋白的酶活测定 | 第61-63页 |
| ·粘红酵母acl1和acl2基因在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中的共表达 | 第63-66页 |
| ·重组载体构建图谱 | 第63页 |
| ·重组质粒验证 | 第63-64页 |
| ·ACL蛋白共表达SDS-PAGE分析 | 第64-65页 |
| ·脂肪酸含量分析结果 | 第65-66页 |
| ·讨论 | 第66-68页 |
| ·原核表达系统 | 第66-67页 |
| ·表达载体和宿主菌的影响 | 第66-67页 |
| ·表达产物的形式 | 第67页 |
| ·蛋白纯化 | 第67页 |
| ·不同菌株来源acl基因的原核表达后的酶活力比较 | 第67-68页 |
| ·本章小结 | 第68-70页 |
| 第四章 粘红酵母acl1和acl2基因在毕赤酵母中的表达 | 第70-82页 |
| ·前言 | 第70页 |
| ·实验材料 | 第70-72页 |
| ·主要仪器设备 | 第70页 |
| ·菌株和质粒 | 第70-71页 |
| ·主要试剂 | 第71页 |
| ·主要试剂溶液的配制 | 第71-72页 |
| ·储存液的配制 | 第71页 |
| ·酵母培养基的配制 | 第71-72页 |
| ·所需引物 | 第72页 |
| ·实验方法 | 第72-74页 |
| ·引物设计 | 第72页 |
| ·重组质粒构建 | 第72页 |
| ·重组质粒的大量提取 | 第72页 |
| ·电转化 | 第72-73页 |
| ·毕赤酵母GS115感受态的制备 | 第72-73页 |
| ·质粒线性化 | 第73页 |
| ·电转化 | 第73页 |
| ·酵母重组子的筛选 | 第73-74页 |
| ·ACL蛋白的小量诱导表达 | 第74页 |
| ·ACL蛋白的纯化 | 第74页 |
| ·ACL蛋白的体外酶学性质的研究 | 第74页 |
| ·实验结果 | 第74-79页 |
| ·重组质粒构建 | 第74-76页 |
| ·重组载体构建图谱 | 第74-75页 |
| ·重组载体双酶切验证 | 第75-76页 |
| ·ACL蛋白的表达和纯化 | 第76-77页 |
| ·重组ACL蛋白酶学性质的研究 | 第77-79页 |
| ·重组ACL蛋白的酶比活力的测定 | 第77-78页 |
| ·重组ACL蛋白酶最适反应条件的优化 | 第78-79页 |
| ·讨论 | 第79-81页 |
| ·宿主菌和表达载体 | 第79-80页 |
| ·ACL蛋白降解问题 | 第80页 |
| ·ACL蛋白毕赤酵母表达后的酶活 | 第80-81页 |
| ·本章小结 | 第81-82页 |
| 第五章 总结与展望 | 第82-83页 |
| ·总结 | 第82页 |
| ·展望 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-89页 |
| 致谢 | 第89-90页 |
| 附录 | 第90页 |
