| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 英文缩略语对照表 | 第10-12页 |
| 实验结果和讨论 | 第12-102页 |
| 第一部分:FcαRI(CD89)在中性粒细胞中的亚细胞定位和FcαR的剪接体表达及功能研究 | 第13-47页 |
| 前言 | 第14-19页 |
| 实验结果 | 第19-37页 |
| 一、FcαR在PMN的亚细胞定位 | 第19-28页 |
| (一) FcαR细胞内储存 | 第19-21页 |
| (二) ELISA分析FcαR的亚细胞定位 | 第21-22页 |
| (三) 共聚焦荧光显微镜分析FcαR亚细胞定位 | 第22-25页 |
| (四) Western blot分析不同颗粒内FcαR | 第25-28页 |
| 二、FcαR在HL60中的表达以及不同分化时期剪接体的鉴定 | 第28-32页 |
| (一) FcαR在不同分化时期HL60的异型表达 | 第28-30页 |
| (二) 检测FcαRI和a.3与人IgA2的结合 | 第30-32页 |
| 三、FcαR的相关功能初步研究 | 第32-37页 |
| (一) PMN细胞FcαR的脱落 | 第32-35页 |
| (二) 不同配体交联的FcαR介导的PMNs的脱颗粒反应 | 第35页 |
| (三) Ca~(2+)、Mg~(2+)对FcαR介导的U937免疫复合物的吞噬的影响 | 第35-37页 |
| 讨论 | 第37-41页 |
| 小结 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-47页 |
| 第二部分:α1-nAchR ECD蛋白的表达以及其单克隆抗体杂交瘤细胞株的获得 | 第47-77页 |
| 前言 | 第48-51页 |
| 实验结果 | 第51-71页 |
| 一、表达和纯化α1-nAchR ECD | 第51-62页 |
| (一) α1-nAchR ECD结构参数分析 | 第51-52页 |
| (二) α1-nAchR膜外区(ECD)在原核中的GST融合表达 | 第52-55页 |
| (三) α1-nAchR ECD-his融合蛋白(28a-213his)的原核表达及复性 | 第55-58页 |
| (四) α1-nAchR ECD-his融合蛋白(Bac-213his)的昆虫表达 | 第58-62页 |
| 二、抗AchR单克隆抗体的制备 | 第62-71页 |
| (一) 小鼠抗28a-213变性蛋白的单克隆抗体的制备 | 第62-64页 |
| (二) 建立实验性重症肌无力的人鼠动物模型(EAMG) | 第64-66页 |
| (三) 大鼠抗28a-213复性蛋白的单克隆抗体的制备 | 第66-70页 |
| (四) 大鼠抗28a-213复性蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞膜表面IgG检测 | 第70-71页 |
| 讨论 | 第71-74页 |
| 小结 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-77页 |
| 第三部分:依赖于FcαRI(CD89)的双特异性分子的构建及其活性研究 | 第77-102页 |
| 前言 | 第78-80页 |
| 实验结果 | 第80页 |
| 一、双特异分子AHF、ALF的构建和活性检测 | 第80-86页 |
| (一) AHF、ALF原核表达载体的构建以及鉴定 | 第80-81页 |
| (二) AHF、ALF在BL21(DE3)E.coli.的表达和复性 | 第81-83页 |
| (三) AHF和ALF活性功能检测 | 第83-86页 |
| 二、双特异分子MIP8aF(ab)_2-19p的构建及活性鉴定 | 第86-94页 |
| (一) MIP8aF(ab)_2-19p的构建 | 第86-88页 |
| (二) MIP8aF(ab)_2-19p与U937和11H12细胞的结合分析 | 第88页 |
| (三) 效应细胞MDM的诱导和检测 | 第88-90页 |
| (四) MIP8aF(ab)_2-19p介导的MDM对11H12细胞的吞噬作用 | 第90-94页 |
| 讨论 | 第94-99页 |
| 小结 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-102页 |
| 实验材料和实验方法 | 第102-137页 |
| 一、实验材料 | 第102-106页 |
| (一) 主要化学试剂 | 第102页 |
| (二) 抗体 | 第102-103页 |
| (三) 实验动物 | 第103页 |
| (四) 细胞系 | 第103页 |
| (五) 工具酶、分子量标准及试剂盒 | 第103-104页 |
| (六) 质粒载体 | 第104页 |
| (七) 菌株 | 第104页 |
| (八) 构建克隆的通用引物 | 第104-105页 |
| (九) 仪器设备 | 第105页 |
| (十) 软件 | 第105-106页 |
| 二、实验方法 | 第106-137页 |
| 【分子生物学相关实验】 | 第106-117页 |
| (一) 常规表达质粒构建 | 第106-108页 |
| (二) 重组蛋白质的原核表达 | 第108-109页 |
| (三) 包涵体蛋白的复性及纯化 | 第109-112页 |
| (四) 半定量RT-PCR反应 | 第112-113页 |
| (五) 哺乳动物细胞转染 | 第113-114页 |
| (六) 转染的CHO细胞稳定株筛选 | 第114页 |
| (七) 昆虫棒状杆菌系统表达外源蛋白质 | 第114-117页 |
| 【常规免疫学相关实验】 | 第117-126页 |
| (一) 多克隆抗体制备与纯化 | 第117-118页 |
| (二) 单克隆抗体的制备和纯化 | 第118-120页 |
| (三) 用NIP抗原柱提纯抗体 | 第120页 |
| (四) 抗体F(ab')_2片段的制备及纯化 | 第120-121页 |
| (五) 荧光流式细胞分析技术(FACS) | 第121-122页 |
| (六) 共聚焦荧光显微镜检测FcαR在中性粒细胞的亚细胞定位 | 第122页 |
| (七) 酶联免疫吸附实验(ELISA) | 第122-124页 |
| (八) 蛋白质的SDS—PAGE梯度凝胶电泳 | 第124-125页 |
| (九) 半干法Western Blot(蛋白印迹) | 第125-126页 |
| 【常规生物化学方法】 | 第126-131页 |
| (一) 荧光标记方法 | 第126-127页 |
| (二) HPR标记抗体 | 第127-128页 |
| (三) 生物素标记抗体 | 第128页 |
| (四) 抗体亲和柱的制备 | 第128-129页 |
| (五) Ellman法测定游离巯基浓度 | 第129-130页 |
| (六) 蛋白质浓度测定 | 第130页 |
| (七) 双特异分子的化学交联和纯化 | 第130-131页 |
| 【免疫学及细胞生物学功能研究实验】 | 第131-137页 |
| (一) 外周血中性粒细胞的分离 | 第131-133页 |
| (二) 中性粒细胞颗粒组分的分离 | 第133-134页 |
| (三) PMNs颗粒组分标志酶鉴定 | 第134页 |
| (四) EAMG建立 | 第134-135页 |
| (五) 效应细胞对靶细胞的吞噬(ADCP) | 第135-136页 |
| (六) FACS检测U937细胞对免疫复合物的吞噬 | 第136页 |
| (七) 脱颗粒反应测定 | 第136-137页 |
| 综述 | 第137-145页 |
| 附录Ⅰ:质料载体图谱和多克隆位点 | 第145-146页 |
| 附录Ⅱ:DNA序列和核酸BLAST比对 | 第146-151页 |
| 附录Ⅲ:攻读博士学位期间发表的文章 | 第151-152页 |
| 致谢 | 第152页 |
