| 独创声明 | 第1页 |
| 学位论文版权使用授权书 | 第3-11页 |
| 摘要 | 第11-14页 |
| Abstract | 第14-18页 |
| 1 前言 | 第18-40页 |
| ·南极微生物多样性 | 第18-20页 |
| ·南极微生物活性物质的研究 | 第20-22页 |
| ·南极微生物适冷酶研究进展 | 第22-27页 |
| ·南极微生物适冷酶种类 | 第22页 |
| ·适冷酶催化特性 | 第22-23页 |
| ·重组适冷酶 | 第23-24页 |
| ·适冷酶的结构特性 | 第24-26页 |
| ·低温催化与酶分子结构 | 第26-27页 |
| ·适冷蛋白酶的研究进展 | 第27-34页 |
| ·蛋白酶的分类 | 第27-28页 |
| ·适冷蛋白酶来源与种类 | 第28-30页 |
| ·适冷蛋白酶酶学特征 | 第30-31页 |
| ·低温促进微生物分泌更多蛋白酶 | 第30页 |
| ·适冷蛋白酶的最适作用温度低 | 第30页 |
| ·适冷蛋白酶的热稳定性差 | 第30-31页 |
| ·适冷蛋白酶的活化能低 | 第31页 |
| ·重组适冷蛋白酶 | 第31页 |
| ·适冷蛋白酶的结构特征 | 第31-33页 |
| ·适冷蛋白酶的应用 | 第33-34页 |
| ·低温微生物的适冷机制 | 第34-38页 |
| ·适冷酶的分泌 | 第34-35页 |
| ·调节膜脂组分 | 第35-36页 |
| ·低温微生物的适冷代谢机制 | 第36页 |
| ·冷激蛋白和抗冻蛋白的合成 | 第36-37页 |
| ·其它细胞可溶性物质 | 第37-38页 |
| ·我国低温微生物和适冷酶的研究状况 | 第38-40页 |
| 2 南极微生物产低温蛋白酶菌株的筛选 | 第40-51页 |
| ·材料与方法 | 第40-43页 |
| ·材料 | 第40-41页 |
| ·培养基 | 第41页 |
| ·菌株培养和胞外蛋白酶提取 | 第41页 |
| ·产低温蛋白酶菌株筛选 | 第41页 |
| ·蛋白酶活力测定 | 第41-42页 |
| ·菌株生长和产酶曲线的测定 | 第42页 |
| ·温度对菌株生长和产酶影响的测定 | 第42页 |
| ·蛋白酶部分酶活特性的测定 | 第42页 |
| ·蛋白酶最适pH 测定 | 第42页 |
| ·蛋白酶最适温度测定 | 第42页 |
| ·蛋白酶的热稳定性测定 | 第42页 |
| ·蛋白酶酶谱（Zymograms） | 第42-43页 |
| ·结果 | 第43-48页 |
| ·南极微生物产蛋白酶菌株的筛选 | 第43-44页 |
| ·4株产蛋白酶南极嗜冷菌生长及部分酶学特性 | 第44-47页 |
| ·温度对4 株产蛋白酶南极嗜冷菌生长及产蛋白酶的影响 | 第45页 |
| ·4 株产蛋白酶南极嗜冷菌生长和产酶曲线 | 第45-46页 |
| ·4 株南极嗜冷菌分泌蛋白酶的酶学特性 | 第46-47页 |
| ·4 株南极嗜冷菌产蛋白酶酶谱分析 | 第47-48页 |
| ·讨论 | 第48-49页 |
| ·结语 | 第49-51页 |
| 3 5 株产蛋白酶南极嗜冷菌的16S rRNA 分子鉴定 | 第51-67页 |
| ·材料与方法 | 第51-57页 |
| ·材料 | 第51-52页 |
| ·5 株南极嗜冷菌16S rRNA 基因序列测定 | 第52-56页 |
| ·细菌培养及菌体收集 | 第52页 |
| ·菌株基因组DNA 的提取（CTAB 方法） | 第52页 |
| ·DNA 电泳鉴定、纯度及浓度的测定 | 第52页 |
| ·引物设计 | 第52-53页 |
| ·PCR 扩增 | 第53页 |
| ·PCR 产物的纯化 | 第53-54页 |
| ·T-A 克隆 | 第54页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备及转化 | 第54页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第54-55页 |
| ·质粒的酶切检验 | 第55页 |
| ·序列分析及数据处理 | 第55-56页 |
| ·菌株NJ341 的表型特征 | 第56-57页 |
| ·形态学特征 | 第56页 |
| ·菌种鉴定 | 第56页 |
| ·脂肪酸分析 | 第56-57页 |
| ·结果 | 第57-64页 |
| ·16S rRNA 基因的PCR 扩增及T-A 克隆、测序结果 | 第57-60页 |
| ·5 株产蛋白酶嗜冷菌16S rRNA 基因序列和系统发育学分析 | 第60-62页 |
| ·菌株NJ341 的表型特征鉴定 | 第62-64页 |
| ·讨论 | 第64-65页 |
| ·结语 | 第65-67页 |
| 4 南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341 产适冷蛋白酶的优化培养 | 第67-85页 |
| ·材料与方法 | 第68-70页 |
| ·材料 | 第68页 |
| ·嗜冷菌C.sp.NJ341 产适冷蛋白酶的优化培养 | 第68-69页 |
| ·通气量对嗜冷菌C.sp.NJ341 生长和产蛋白酶影响的测定 | 第68页 |
| ·初始pH 值对嗜冷菌C.sp.NJ341 生长和产蛋白酶影响的测定 | 第68页 |
| ·盐度对嗜冷菌C.sp.NJ341 生长和产蛋白酶影响的测定 | 第68页 |
| ·最适氮源和碳源种类的筛选 | 第68页 |
| ·金属离子和表面活性剂对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶影响的测定 | 第68-69页 |
| ·氨基酸对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶影响的测定 | 第69页 |
| ·响应面分析法(RSM)实验设计 | 第69-70页 |
| ·菌株的生长和产蛋白酶曲线的测定 | 第70页 |
| ·产酶稳定性试验 | 第70页 |
| ·结果 | 第70-80页 |
| ·通气量和初始pH 值对嗜冷菌C.sp.NJ341 生长和产酶的影响 | 第70页 |
| ·盐度对嗜冷菌C.sp.NJ341 生长和产酶的影响 | 第70-71页 |
| ·氮源和碳源对嗜冷菌C.sp.NJ341 产酶的影响 | 第71-73页 |
| ·金属离子、表面活性剂和氨基酸对嗜冷菌C.sp.NJ341 产酶的影响 | 第73页 |
| ·利用响应面法对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶优化培养 | 第73-79页 |
| ·嗜冷菌C.sp.NJ341 的生长和产蛋白酶曲线 | 第79页 |
| ·嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶稳定性 | 第79-80页 |
| ·讨论 | 第80-83页 |
| ·氮源对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶的影响 | 第80-81页 |
| ·碳源对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶的影响 | 第81页 |
| ·盐度对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶的影响 | 第81-82页 |
| ·利用响应面法对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶优化条件 | 第82-83页 |
| ·结语 | 第83-85页 |
| 5 南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341 产适冷蛋白酶的分离纯化 | 第85-98页 |
| ·材料与方法 | 第85-89页 |
| ·材料 | 第85-86页 |
| ·培养基与培养 | 第86页 |
| ·纯化方法 | 第86-87页 |
| ·硫酸铵盐析 | 第86页 |
| ·DEAE-Sephadex A50 柱层析 | 第86-87页 |
| ·Sephadex G-75 柱层析 | 第87页 |
| ·DEAE-Sepharose Fast Folw 柱层析 | 第87页 |
| ·蛋白质含量的测定 | 第87页 |
| ·蛋白质的电泳 | 第87页 |
| ·蛋白酶酶谱（Zymograms） | 第87-88页 |
| ·高效液相色谱（HPLC）对蛋白酶纯度的鉴定 | 第88页 |
| ·MALDI-TOF MS 对纯化蛋白酶的分子量测定 | 第88页 |
| ·纯化蛋白酶的肽指纹图谱鉴定 | 第88-89页 |
| ·结果 | 第89-94页 |
| ·适冷蛋白酶的纯化 | 第89-92页 |
| ·硫酸铵沉淀 | 第89页 |
| ·DEAE-Sephadex A50 离子交换 | 第89页 |
| ·Sephadex G-75 凝胶过滤 | 第89-90页 |
| ·DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换 | 第90-92页 |
| ·HPLC 对纯化后蛋白酶纯度的鉴定结果 | 第92-93页 |
| ·蛋白酶的分子量 | 第93页 |
| ·纯化后蛋白酶的肽指纹图谱分析 | 第93-94页 |
| ·讨论 | 第94-97页 |
| ·适冷蛋白酶的纯化 | 第94-96页 |
| ·适冷蛋白酶分子量测定及肽指纹图谱分析 | 第96-97页 |
| ·结语 | 第97-98页 |
| 6 南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341 适冷蛋白酶酶学性质的研究 | 第98-111页 |
| ·材料和方法 | 第98-100页 |
| ·材料 | 第98页 |
| ·方法 | 第98-100页 |
| ·蛋白酶活力的测定 | 第98页 |
| ·不同温度下蛋白酶活力的测定 | 第98-99页 |
| ·不同pH 值下蛋白酶活力的测定 | 第99页 |
| ·不同NaCl 浓度下蛋白酶的活力的测定 | 第99页 |
| ·金属离子、表面活性剂和抑制剂等物质对蛋白酶活力影响的测定 | 第99页 |
| ·蛋白酶动力学常数测定 | 第99-100页 |
| ·蛋白酶酶解效果的测定 | 第100页 |
| ·结果 | 第100-105页 |
| ·不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341 的蛋白酶活力 | 第100-101页 |
| ·不同pH 下嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的活力 | 第101-102页 |
| ·不同NaCl 浓度下嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的活力 | 第102-103页 |
| ·抑制剂和金属离子对嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的影响结果 | 第103-104页 |
| ·嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的动力学性质 | 第104页 |
| ·嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶酶解效果 | 第104-105页 |
| ·讨论 | 第105-109页 |
| ·温度对嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的影响 | 第105-107页 |
| ·pH 对嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的影响 | 第107页 |
| ·盐度对嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的影响 | 第107页 |
| ·抑制剂和金属离子对嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的影响 | 第107-108页 |
| ·嗜冷菌C.sp.NJ341 适冷蛋白酶动力学常数 | 第108-109页 |
| ·嗜冷菌C.sp.NJ341 适冷蛋白酶酶解效果 | 第109页 |
| ·结语 | 第109-111页 |
| 7 南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341 低温适应性的研究 | 第111-129页 |
| ·材料与方法 | 第111-116页 |
| ·材料与培养基 | 第111页 |
| ·温度设定 | 第111-112页 |
| ·菌株的生长测定 | 第112页 |
| ·细胞内蛋白质含量的测定 | 第112页 |
| ·蛋白质样品的制备 | 第112页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 | 第112页 |
| ·双向凝胶电泳分离 | 第112-114页 |
| ·第一向等电聚焦（Isoelectric focusing） | 第113页 |
| ·IPG 胶条的平衡 | 第113-114页 |
| ·第二向SDS-PAGE | 第114页 |
| ·蛋白质点的采集与分析 | 第114页 |
| ·质谱样品的制备和质谱鉴定 | 第114-115页 |
| ·Coomassie Stained 胶内消化 | 第114-115页 |
| ·质谱分析 | 第115页 |
| ·数据的分析和比对 | 第115页 |
| ·谷胱甘肽硫转移酶（GST）活力的测定 | 第115-116页 |
| ·丙二醛（MDA）含量的测定 | 第116页 |
| ·细胞脂肪酸的分析 | 第116页 |
| ·结果 | 第116-124页 |
| ·不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341 生长和细胞内蛋白质含量 | 第116-117页 |
| ·不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341 细胞内蛋白表达的SDS-PAGE | 第117页 |
| ·嗜冷菌C.sp.NJ341 细胞内蛋白质双向电泳 | 第117-118页 |
| ·不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341 细胞内蛋白表达的双向电泳 | 第118-121页 |
| ·差异蛋白点a 和c 的鉴定结果 | 第121-122页 |
| ·不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341GST 活力 | 第122页 |
| ·不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341MDA 含量 | 第122-123页 |
| ·不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341 脂肪酸含量 | 第123-124页 |
| ·讨论 | 第124-128页 |
| ·温度对嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白质含量的影响 | 第124-125页 |
| ·冷激蛋白与嗜冷菌C.sp.NJ341 低温适应性关系 | 第125-126页 |
| ·谷胱甘肽硫转移酶与嗜冷菌C.sp.NJ341 低温适应性关系 | 第126-127页 |
| ·温度对嗜冷菌C.sp.NJ341 脂肪酸含量的影响 | 第127-128页 |
| ·结语 | 第128-129页 |
| 8 结论 | 第129-133页 |
| ·南极微生物产适冷蛋白酶菌株的筛选 | 第129页 |
| ·5 株南极微生物产蛋白酶菌株的16S rRNA 分子鉴定 | 第129-130页 |
| ·南极嗜冷菌C.sp.NJ341 产适冷蛋白酶发酵优化培养 | 第130页 |
| ·南极嗜冷菌C.sp.NJ3411 产适冷蛋白酶的分离纯化 | 第130页 |
| ·南极嗜冷菌C.sp.NJ341 适冷蛋白酶的酶学性质 | 第130-131页 |
| ·南极嗜冷菌C.sp.NJ341 对低温的适应性 | 第131-133页 |
| 参考文献 | 第133-151页 |
| 攻读博士期间发表文章 | 第151-153页 |
| 致谢 | 第153页 |
