| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 缩略词表 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述:苹果茎痘病毒的研究进展 | 第13-20页 |
| 1．1 研究历史及其与其它病毒的关系 | 第13-14页 |
| 1．2 生物学特性 | 第14-15页 |
| 1．3 粒体形态、体外生物学活性及细胞病理学 | 第15页 |
| 1．4 基因组结构和组成 | 第15页 |
| 1．5 检测技术 | 第15-18页 |
| 1．5．1 生物学鉴定 | 第16页 |
| 1．5．2 血清学技术 | 第16-17页 |
| 1．5．3 分子生物学技术 | 第17-18页 |
| 1．6 防治对策 | 第18页 |
| 1．7 CP基因抗病毒基因工程的研究进展 | 第18-19页 |
| 1．7．1 CP基因抗病毒基因工程的应用 | 第18-19页 |
| 1．7．2 CP基因介导抗性机制 | 第19页 |
| 1．8 目的及意义 | 第19-20页 |
| 第二章 砂梨上苹果茎痘病毒的快速检测 | 第20-35页 |
| 2．1 ASPV的生物学检测 | 第20-25页 |
| 2．1．1 试验材料 | 第20页 |
| 2．1．1．1 待检砂梨样品 | 第20页 |
| 2．1．1．2 指示植物 | 第20页 |
| 2．1．1．3 接种缓冲液 | 第20页 |
| 2．1．2 试验方法 | 第20-21页 |
| 2．1．2．1 汁液摩擦接种 | 第20页 |
| 2．1．2．2 二重芽接法 | 第20-21页 |
| 2．1．3 结果与分析 | 第21-22页 |
| 2．1．3．1 草本指示植物检测 | 第21页 |
| 2．1．3．2 木本指示植物检测 | 第21页 |
| 2．1．3．3 草本指示植物和木本指示植物检测结果比较 | 第21-22页 |
| 2．1．3．4 接种缓冲液对病毒检测效果的影响 | 第22页 |
| 2．1．4 结论与讨论 | 第22-25页 |
| 2．2 ASPV的血清学检测 | 第25-28页 |
| 2．2．1 试验材料 | 第25页 |
| 2．2．1．1 待检砂梨样品 | 第25页 |
| 2．2．1．2 主要试剂 | 第25页 |
| 2．2．1．3 样品提取缓冲液 | 第25页 |
| 2．2．2 试验方法 | 第25-26页 |
| 2．2．2．1 PAS-ELISA(Protein A sandwich ELISA)检测 | 第25-26页 |
| 2．2．2．2 改进的PAS-ELISA检测 | 第26页 |
| 2．2．2．3 直接包被抗原ELISA(Plate trapped antigen indirect ELISA，PTA-ELISA)检测 | 第26页 |
| 2．2．3 结果与分析 | 第26-28页 |
| 2．2．3．1 砂梨上ASPV的潜带状况 | 第26页 |
| 2．2．3．2 不同检测方法检测结果的比较 | 第26-27页 |
| 2．2．3．3 样品最佳稀释倍数的确定 | 第27-28页 |
| 2．2．3．4 改进PAS-ELISA方法检测ASPV最佳条件 | 第28页 |
| 2．2．4 结论与讨论 | 第28页 |
| 2．3 ASPV分子生物学检测 | 第28-33页 |
| 2．3．1 试验材料 | 第28-29页 |
| 2．3．1．1 待检材料 | 第28页 |
| 2．3．1．2 主要试剂 | 第28页 |
| 2．3．1．3 引物 | 第28-29页 |
| 2．3．2 试验方法 | 第29-31页 |
| 2．3．2．1 dsRNA的提取 | 第29页 |
| 2．3．2．2 反转录合成第一链cDNA | 第29-30页 |
| 2．3．2．3 PCR扩增 | 第30页 |
| 2．3．2．4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测 | 第30页 |
| 2．3．2．5 试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR) | 第30-31页 |
| 2．3．2．6 PCR产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(PAGE) | 第31页 |
| 2．3．3 结果与分析 | 第31-33页 |
| 2．3．3．1 以dsRNA为模板的RT-PCR检测 | 第31-32页 |
| 2．3．3．2 TC-RT-PCR检测 | 第32-33页 |
| 2．3．4 结论与讨论 | 第33页 |
| 2．4 砂梨上ASPV三种检测方法的综合比较 | 第33-35页 |
| 2．4．1 田间样品的病毒检测结果 | 第33-34页 |
| 2．4．2 结论与讨论 | 第34-35页 |
| 第三章 ASPV的CP基因的克隆及其原核表达 | 第35-50页 |
| 3．1 试验材料 | 第35-36页 |
| 3．1．1 质粒、菌株、样品 | 第35-36页 |
| 3．1．2 主要试剂 | 第36页 |
| 3．2 试验方法 | 第36-42页 |
| 3．2．1 引物设计 | 第36页 |
| 3．2．2 ASPV dsRNA的抽提和CP基因cDNA第一链合成 | 第36页 |
| 3．2．3 CP基因的PCR扩增 | 第36-37页 |
| 3．2．4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测 | 第37页 |
| 3．2．5 特异目标片断的回收与纯化 | 第37页 |
| 3．2．6 连接 | 第37-38页 |
| 3．2．7 质粒转化宿主菌 | 第38页 |
| 3．2．7．1 感受态细胞的制备 | 第38页 |
| 3．2．7．2 电击转化大肠杆菌 | 第38页 |
| 3．2．8 蓝/白斑筛选 | 第38页 |
| 3．2．9 质粒DNA的制备和纯化 | 第38-39页 |
| 3．2．10 重组质粒的鉴定 | 第39页 |
| 3．2．10．1 PCR鉴定 | 第39页 |
| 3．2．10．2 质粒酶切鉴定 | 第39页 |
| 3．2．11 序列测定和分析 | 第39页 |
| 3．2．12 外源基因的原核表达 | 第39-42页 |
| 3．2．12．1 原核表达载体的构建 | 第39-40页 |
| 3．2．12．2 载体pE128c质粒的提纯、酶切与纯化 | 第40页 |
| 3．2．12．3 含目的基因的重组表达载体的获得 | 第40-41页 |
| 3．2．12．4 诱导和检测 | 第41页 |
| 3．2．12．5 SDS-PAGE | 第41-42页 |
| 3．2．12．6 Western-blot | 第42页 |
| 3．3 结果与分析 | 第42-49页 |
| 3．3．1 CP基因的RT-PCR扩增 | 第42-43页 |
| 3．3．2 重组克隆质粒的PCR检测 | 第43页 |
| 3．3．3 重组克隆质粒酶切检测 | 第43-44页 |
| 3．3．4 来源于砂梨样品6-1-3的ASPV CP基因序列分析 | 第44-48页 |
| 3．3．5 CP基因在大肠杆菌中的表达 | 第48页 |
| 3．3．6 原核表达产物的western-blot分析 | 第48-49页 |
| 3．4 结论与讨论 | 第49-50页 |
| 第四章 研究展望 | 第50-53页 |
| 参考文献 | 第53-57页 |
| 致谢 | 第57页 |
