| 中文摘要 | 第1-15页 |
| 英文摘要 | 第15-21页 |
| 符号说明 | 第21-23页 |
| 前言 | 第23-29页 |
| 总体技术路线 | 第29-30页 |
| 第一部分 HBV转染对TRAIL诱导凋亡的影响及机制探讨 | 第30-91页 |
| 第一节 含1.1倍、3.0倍HBV全基因组真核表达载体的构建及表达 | 第31-52页 |
| 技术路线 | 第31-32页 |
| 材料与方法 | 第32-46页 |
| 1.材料 | 第32-35页 |
| 2.方法 | 第35-46页 |
| ·质粒p3.6Ⅱ、pUC19-3.0HBV、pcDNA3的转化、扩增与提取 | 第35-39页 |
| ·E.coli DH5α感受态的制备 | 第35-36页 |
| ·质粒p3.6Ⅱ、pUCl9—3.0HBV和pcDNA3的转化 | 第36页 |
| ·碱变性法小量制备质粒DNA | 第36-37页 |
| ·碱裂解法大量制备质粒DNA和聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA | 第37-38页 |
| ·试剂盒小量提取质粒 | 第38-39页 |
| ·质粒p3.6Ⅱ、pUC19—3.0HBV的酶切及目的基因片段的回收、纯化 | 第39-41页 |
| ·质粒p3.6Ⅱ、pUC19—3.0HBV的酶切 | 第39页 |
| ·目的基因片段的回收与纯化 | 第39-40页 |
| ·载体pcDNA3的线性化和5′端去磷酸化修饰 | 第40-41页 |
| ·目的基因与载体的连接、转化及初步鉴定 | 第41-43页 |
| ·目的基因与载体的连接 | 第41-42页 |
| ·感受态细菌的制备 | 第42页 |
| ·重组质粒的转化 | 第42页 |
| ·阳性重组子的筛选鉴定 | 第42-43页 |
| ·目的基因插入方向的鉴定和序列分析 | 第43-44页 |
| ·酶切鉴定目的基因的插入方向 | 第43-44页 |
| ·DNA自动测序与序列分析 | 第44页 |
| ·重组质粒稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 | 第44-46页 |
| ·BEL-7402、HepG2细胞的传代培养 | 第44页 |
| ·基因转导 | 第44-45页 |
| ·克隆筛选 | 第45页 |
| ·稳定筛选细胞的鉴定 | 第45-46页 |
| 结果 | 第46-50页 |
| 1.质粒p3.6Ⅱ、pUC19-3.0HBV、pcDNA3的酶切鉴定 | 第46-47页 |
| ·p3.6Ⅱ、pcDNA3的酶切鉴定 | 第46页 |
| ·pUC19-3.0HBV、pcDNA3的酶切鉴定 | 第46-47页 |
| 2.pcDNA3-1.1HBV、pcDNA3-3.0HBV真核表达载体的构建及鉴定 | 第47-48页 |
| ·目的基因和载体的酶切回收 | 第47页 |
| ·目的基因与载体的连接、转化 | 第47页 |
| ·目的基因插入方向的鉴定和序列分析 | 第47-48页 |
| ·阳性重组子的酶切鉴定 | 第48页 |
| ·DNA测序及序列分析 | 第48页 |
| 3.重组质粒稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 | 第48-50页 |
| ·肝癌细胞BEL-7402、HepG2的培养 | 第48-49页 |
| ·阳性细胞克隆的筛选 | 第49页 |
| ·稳定筛选细胞的鉴定 | 第49-50页 |
| ·HBpreS2、HBx mRNA表达的检测 | 第49页 |
| ·HBsAg、HBeAg表达的检测 | 第49-50页 |
| 讨论 | 第50-52页 |
| 第二节 HBV转染对TRAIL诱导凋亡的影响 | 第52-65页 |
| 材料与方法 | 第52-59页 |
| 1.材料 | 第52-54页 |
| 2.方法 | 第54-59页 |
| ·CCK-8检测TRAIL对细胞生长的抑制效应 | 第54页 |
| ·TUNEL检测TRAIL诱导的凋亡效应 | 第54-55页 |
| ·Caspase3活性检测分析TRAIL诱导的凋亡 | 第55-56页 |
| ·DNA Ladder检测TRAIL诱导的细胞的凋亡 | 第56页 |
| ·Western blot检测Caspase3前体表达分析TRAIL诱导的凋亡 | 第56-59页 |
| ·细胞的准备 | 第56-57页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第57-58页 |
| ·Western blot检测Caspase3前体蛋白的表达 | 第58-59页 |
| 结果 | 第59-61页 |
| 1.HBV转染增强TRAIL对细胞的生长抑制效应 | 第59页 |
| 2.HBV转染促进TRAIL诱导的细胞凋亡 | 第59-61页 |
| ·TUNEL检测结果 | 第59-60页 |
| ·Caspase3活性的检测结果 | 第60页 |
| ·DNA Ladder检测结果 | 第60页 |
| ·Caspase3前体蛋白的表达 | 第60-61页 |
| 讨论 | 第61-65页 |
| 第三节 HBV转染促进TRAIL诱导凋亡的机制研究 | 第65-80页 |
| 技术路线 | 第65-66页 |
| 材料与方法 | 第66-74页 |
| 1.材料 | 第66-69页 |
| 2.方法 | 第69-74页 |
| ·胞外水平的检测 | 第69-71页 |
| ·半定量RT-PCR检测TRAIL受体的表达 | 第69-71页 |
| ·引物的设计与合成 | 第69页 |
| ·RT-PCR | 第69-71页 |
| ·流式细胞术检测TRAIL受体的表达 | 第71页 |
| ·胞内水平的检测 | 第71-74页 |
| ·线粒体非依赖途径的检测 | 第71-72页 |
| ·Western blot检测Caspase8前体的表达 | 第71-72页 |
| ·线粒体依赖途径的检测 | 第72页 |
| ·Western blot检测Caspase9前体的表达 | 第72页 |
| ·凋亡通路中调节分子的检测 | 第72-74页 |
| ·Western blot检测Bax的表达 | 第72页 |
| ·Westetn blot检测FLIP的表达 | 第72-73页 |
| ·双荧光素酶报告基因系统检测NF-κB的活性 | 第73-74页 |
| 结果 | 第74-75页 |
| 1.HBV转染前后TRAIL受体的表达差异研究 | 第74页 |
| ·TRAIL受体mRNA的表达 | 第74页 |
| ·TRAIL受体蛋白的表达 | 第74页 |
| 2.HBV转染前后TRAIL凋亡通路中胞内分子的差异研究 | 第74-75页 |
| ·线粒体非依赖途径 | 第74页 |
| ·线粒体依赖途径 | 第74页 |
| ·凋亡通路中调节分子的比较 | 第74-75页 |
| 讨论 | 第75-80页 |
| 第四节 IFN-γ对TRAIL诱导HBV转染细胞凋亡的影响及机制研究 | 第80-85页 |
| 技术路线 | 第80-81页 |
| 材料与方法 | 第81-83页 |
| 1.材料 | 第81页 |
| 2.方法 | 第81-83页 |
| ·TUNEL检测IFN-γ联合TRAIL诱导的细胞凋亡 | 第81-82页 |
| ·半定量RT-PCR检测TRAIL受体的表达 | 第82页 |
| ·半定量RT-PCR检测凋亡抑制分子FLIP mRNA的表达 | 第82-83页 |
| 结果 | 第83页 |
| 1.IFN-γ促进TRAIL诱导的HepG2／1.1HBV凋亡 | 第83页 |
| 2.IFN-γ对HepG2／1.1HBV细胞TRAIL受体表达的影响 | 第83页 |
| 3.IFN-γ对HepG2／1.1HBV细胞中凋亡抑制蛋白FLIP表达的影响 | 第83页 |
| 讨论 | 第83-85页 |
| 第五节 慢性乙肝患者外周血单个核细胞TRAIL受体的表达及意义 | 第85-91页 |
| 材料与方法 | 第85-87页 |
| 1.材料 | 第85-86页 |
| 2.方法 | 第86-87页 |
| ·RT-PCR检测外周血单个核细胞TRAIL受体的表达 | 第86-87页 |
| ·流式细胞术检测外周血单个核细胞TRAIL受体的表达 | 第87页 |
| ·肝功能测定 | 第87页 |
| ·统计学处理 | 第87页 |
| 结果 | 第87-89页 |
| 1.外周血单个核细胞TRAIL受体的表达 | 第87-88页 |
| 2.慢性乙肝患者外周血单个核细胞DcR1的表达与临床分期的关系 | 第88页 |
| 3.慢性乙肝患者外周血单个核细胞DcR1的表达与临床指标的相关性 | 第88-89页 |
| 讨论 | 第89-90页 |
| 小结 | 第90-91页 |
| 第二部分 HBV转染对TWEAK诱导凋亡的影响及IFN-γ对TWEAK诱导凋亡的调节 | 第91-96页 |
| 材料与方法 | 第91-93页 |
| 1.材料 | 第91-92页 |
| 2.方法 | 第92-93页 |
| ·CCK-8检测TWEAK对细胞生长的抑制效应 | 第92页 |
| ·TUNEL检测TWEAK诱导的细胞凋亡 | 第92-93页 |
| ·TUNEL检测IFN-γ联合TWEAK诱导的细胞凋亡 | 第93页 |
| 结果 | 第93-94页 |
| 1.HBV转染增强TWEAK对细胞生长的抑制效应 | 第93页 |
| 2.HBV转染促进TWEAK诱导的细胞凋亡 | 第93-94页 |
| 3.IFN-γ促进TWEAK诱导的BEL-7402／1.1HBV、HepG2／1.1HBV凋亡 | 第94页 |
| 讨论 | 第94-95页 |
| 小结 | 第95-96页 |
| 附图 | 第96-107页 |
| 参考文献 | 第107-117页 |
| 致谢 | 第117-118页 |
| 博士在读期间发表论文及论著目录 | 第118-120页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第120页 |
