| 1 前言 | 第1-23页 |
| ·木素的生物降解 | 第8页 |
| ·木素生物降解的研究现状 | 第8页 |
| ·木素生物降解研究的目的及意义 | 第8页 |
| ·木素降解体系 | 第8页 |
| ·木素过氧化物酶 | 第8-11页 |
| ·木质素过氧化物酶同功酶的物理及酶学特性 | 第9页 |
| ·木质素过氧化物酶发酵条件的研究 | 第9-10页 |
| ·木质素过氧化物酶的降解机制 | 第10-11页 |
| ·lip基因的研究 | 第11-12页 |
| ·lip基因的结构 | 第11页 |
| ·lip基因的表达调控 | 第11-12页 |
| ·木质素过氧化物酶的异源表达 | 第12-13页 |
| ·酵母表达系统 | 第13-21页 |
| ·酿酒酵母表达系统 | 第13-14页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第14-20页 |
| ·宿主菌 | 第16-17页 |
| ·载体元件 | 第17-19页 |
| ·启动子 | 第17-18页 |
| ·选择标记 | 第18页 |
| ·信号肽 | 第18-19页 |
| ·载体的整合 | 第19页 |
| ·表达产物的翻译后修饰 | 第19-20页 |
| ·蛋白表达量 | 第20页 |
| ·影响外源基因在酵母中表达的因素 | 第20-21页 |
| ·酵母启动子 | 第20页 |
| ·酵母密码子使用偏向性 | 第20-21页 |
| ·酵母菌的分泌信号 | 第21页 |
| ·外源蛋白的糖基化 | 第21页 |
| ·载体质粒 | 第21页 |
| ·本论文的立题依据及研究内容 | 第21-23页 |
| ·立题依据 | 第21-22页 |
| ·主要研究内容 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-42页 |
| ·实验材料 | 第23-28页 |
| ·菌株与质粒 | 第23页 |
| ·引物 | 第23页 |
| ·主要试剂 | 第23-25页 |
| ·工具酶 | 第23页 |
| ·试剂盒 | 第23页 |
| ·化学试剂 | 第23-25页 |
| ·Marker | 第25页 |
| ·培养基和溶液 | 第25-28页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·相关溶液 | 第25-28页 |
| ·主要仪器和设备 | 第28页 |
| ·实验方法 | 第28-42页 |
| ·木质素过氧化物酶基因的克隆 | 第28-32页 |
| ·黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶活力的测定 | 第28页 |
| ·黄孢原毛平革菌生长曲线和产酶曲线的测定 | 第28-29页 |
| ·黄孢原毛平革菌的总RNA的提取 | 第29页 |
| ·RT-PCR扩增 | 第29-31页 |
| ·RT-PCR产物的纯化 | 第31页 |
| ·DNA片段的双酶切 | 第31页 |
| ·DNA片段的割胶纯化 | 第31-32页 |
| ·克隆载体pUC19-lipH8的构建及转化大肠杆菌 | 第32-35页 |
| ·pUC19质粒的双酶切 | 第32页 |
| ·pUC19质粒双酶切片段的纯化 | 第32-33页 |
| ·连接反应 | 第33页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第33页 |
| ·连接产物转化E.coli DH5α | 第33页 |
| ·重组子的的筛选 | 第33-34页 |
| ·重组子质粒的小量提取 | 第34页 |
| ·重组子质粒的酶切鉴定 | 第34-35页 |
| ·重组子的PCR鉴定 | 第35页 |
| ·目的基因的测序 | 第35页 |
| ·表达载体pMET6 α A-lipH8的构建及转化甲醇毕赤酵母 | 第35-37页 |
| ·载体pMET a A的双酶切 | 第35-36页 |
| ·酶切片段的割胶纯化 | 第36页 |
| ·连接反应 | 第36页 |
| ·表达载体pMET α A-lipH8转化大肠杆菌DH5 α扩增 | 第36页 |
| ·重组质粒pMET α A-lipH8的线性化及纯化 | 第36页 |
| ·Pichia methanolica感受态细胞的制备 | 第36-37页 |
| ·电转化Pichia methanolica | 第37页 |
| ·转化子的鉴定 | 第37-41页 |
| ·转化子的表型鉴定 | 第37-38页 |
| ·转化子的诱导表达 | 第38页 |
| ·转化子总DNA的提取 | 第38-39页 |
| ·转化子中目的基因的PCR方法检测 | 第39页 |
| ·SDS-PAGE法鉴定转化子 | 第39-41页 |
| ·工程菌菌种特性的研究及表达优化 | 第41-42页 |
| ·生长曲线及pH曲线的测定 | 第41页 |
| ·表达条件优化 | 第41-42页 |
| 3 结果与讨论 | 第42-65页 |
| ·木质素过氧化物酶基因的克隆 | 第42-44页 |
| ·出发菌株菌种特性研究 | 第42页 |
| ·引物的设计 | 第42-43页 |
| ·黄孢原毛平革菌的总RNA的提取 | 第43页 |
| ·RT-PCR扩增目的基因 | 第43-44页 |
| ·重组质粒pUC19-lipH8的构建及转化大肠杆菌 | 第44-48页 |
| ·重组质粒pUC19-lipH8的构建 | 第44-45页 |
| ·转化大肠杆菌 | 第45-46页 |
| ·重组子的筛选和鉴定 | 第46-48页 |
| ·通过α互补筛选重组子 | 第46页 |
| ·重组子的酶切鉴定 | 第46页 |
| ·重组子的PCR鉴定 | 第46-48页 |
| ·基因lipH8序列测定结果 | 第48-49页 |
| ·表达载体pMET α A-lipH8的构建 | 第49-53页 |
| ·载体pMET α A特性 | 第49-51页 |
| ·表达载体pMET α A-lipH8的构建 | 第51-52页 |
| ·表达载体pMET α A-lipH8转化大肠杆菌DH5 α及重组子的鉴定 | 第52-53页 |
| ·表达载体pMET α A-lipH8转化Pichia methanolica PMAD16 | 第53-56页 |
| ·宿主Pichia methanolica PMAD16菌种特性 | 第53页 |
| ·甲醇毕赤酵母生长曲线的测定 | 第53-54页 |
| ·表达载体pMET α A-lipH8的线性化 | 第54页 |
| ·甲醇毕赤酵母PMAD16电转化条件的优化 | 第54-56页 |
| ·电转化效果的评价 | 第54页 |
| ·酵母细胞的不同生长状态对转化率的影响 | 第54页 |
| ·感受态细胞冻存方式和冻存时间对转化率的影响 | 第54-55页 |
| ·质粒DNA浓度对转化率的影响 | 第55-56页 |
| ·电场强度对转化率的影响 | 第56页 |
| ·pMET α A-lipH8的酵母转化子的筛选与鉴定 | 第56-59页 |
| ·转化子的表型定 | 第56-57页 |
| ·酵母转化子的PCR法鉴定 | 第57-58页 |
| ·酵母转化子的SDS-PAGE法鉴定 | 第58-59页 |
| ·工程菌菌株特性的研究 | 第59-60页 |
| ·酵母转化子的生长曲线和pH曲线 | 第59-60页 |
| ·酵母转化子的产酶曲线 | 第60页 |
| ·工程菌表达条件优化 | 第60-65页 |
| ·不同培养基对Lip表达的影响 | 第60-61页 |
| ·缓冲液对Lip表达的影响 | 第61-62页 |
| ·甲醇诱导浓度对Lip表达的影响 | 第62-63页 |
| ·装液量对Lip表达的影响 | 第63页 |
| ·接种量对Lip表达的影响 | 第63-65页 |
| 4 结论 | 第65-66页 |
| 5 展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 论文发表情况 | 第72-73页 |
| 附录 | 第73-74页 |
