| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 前言 | 第9-16页 |
| 第一部分 人纤溶酶原K5基因的合成、在大肠杆菌中的表达和纯化 | 第16-28页 |
| 一、实验材料 | 第16-18页 |
| 二、实验方法 | 第18-21页 |
| 1.人Pgn K5全基因合成 | 第18-19页 |
| 2.重组质粒pThioHisA-hK5的构建 | 第19页 |
| 3.hK5基因在大肠杆菌中的表达 | 第19页 |
| 4.EhK5重组蛋白质的制备 | 第19-20页 |
| ·工程菌的培养 | 第19-20页 |
| ·超声破碎菌体 | 第20页 |
| ·包涵体的溶解和复性 | 第20页 |
| ·EhK5融合蛋白的纯化 | 第20页 |
| 5.EhK5融合蛋白的肠激酶切割及纯化 | 第20-21页 |
| ·EhK5融合蛋白的肠激酶切割 | 第20-21页 |
| ·EhK5非融合蛋白的纯化 | 第21页 |
| 6.EhK5非融合蛋白的Western Blot检测 | 第21页 |
| 三、实验结果 | 第21-25页 |
| 1.hK5的全基因合成 | 第21-23页 |
| ·hK5基因的PCR扩增 | 第21页 |
| ·重组质粒pThioHisA-hK5的构建及序列分析 | 第21-23页 |
| 2.hK5基因在大肠杆菌中的表达 | 第23页 |
| 3.EhK5重组蛋白的纯化及肠激酶切割 | 第23-24页 |
| 4.EhK5的Western Blot检测 | 第24-25页 |
| 四、讨论 | 第25-28页 |
| 第二部分 人Pgn K5在毕赤酵母中的高效分泌表达与纯化 | 第28-52页 |
| 一、实验材料 | 第29-30页 |
| 1.菌株和质粒 | 第29-30页 |
| 2.工具酶、抗体、试剂盒及化学试剂 | 第30页 |
| 二、实验方法 | 第30-34页 |
| 1.α-K5融合基因的构建 | 第30-31页 |
| 2.携带多拷贝表达盒的重组质粒构建 | 第31页 |
| ·重组质粒p819-α-K5的构建 | 第31页 |
| ·重组质粒p819-8α-K5的构建 | 第31页 |
| 3.分泌表达hK5的重组毕赤酵母菌的构建 | 第31-32页 |
| ·质粒转化P.Pastoris宿主菌GS115 | 第31页 |
| ·稳定整合转化子的筛选 | 第31-32页 |
| ·表达菌株甲醇利用表型的鉴定 | 第32页 |
| ·hK5在P.pastoris中的分泌表达 | 第32页 |
| 4.YhK5重组蛋白的制备 | 第32-34页 |
| ·摇瓶发酵条件探索 | 第32-33页 |
| ·重组YhK5的纯化 | 第33-34页 |
| ·DEAE—Sepharose离子交换层析 | 第33-34页 |
| ·Sephadex G-75凝胶过滤 | 第34页 |
| ·超滤浓缩 | 第34页 |
| ·YhK5重组蛋白质的免疫学鉴定 | 第34页 |
| 三、实验结果 | 第34-43页 |
| 1.α-K5融合基因的构建 | 第34-35页 |
| 2.携带多拷贝表达盒的重组质粒构建 | 第35-37页 |
| ·重组质粒p819-α-K5的构建 | 第35-36页 |
| ·重组质粒p819-8α-K5的构建 | 第36-37页 |
| 3.分泌表达YhK5的重组毕赤酵母菌的构建 | 第37-39页 |
| ·质粒转化P.Pastoris宿主菌GS115 | 第37-38页 |
| ·稳定整合转化子的筛选 | 第38页 |
| ·表达菌株甲醇利用表型的鉴定 | 第38页 |
| ·hK5在P.pastoris中的分泌表达检测 | 第38-39页 |
| 4.YhK5重组蛋白的制备 | 第39-43页 |
| ·摇瓶发酵条件探索 | 第39-41页 |
| ·重组YhK5的纯化 | 第41-42页 |
| ·重组YhK5的免疫学鉴定 | 第42-43页 |
| 四、讨论 | 第43-52页 |
| 第三部分 重组hK5的生物学活性鉴定 | 第52-67页 |
| 一、实验材料 | 第52-53页 |
| 1.细胞株 | 第52页 |
| 2.培养基及重组蛋白 | 第52-53页 |
| 3.实验动物 | 第53页 |
| 4.实验器材 | 第53页 |
| 二、实验方法 | 第53-55页 |
| 1.内皮细胞抑制实验 | 第53-54页 |
| 2.鸡胚尿囊膜实验 | 第54页 |
| 3.小鼠肿瘤抑制实验 | 第54-55页 |
| 三、实验结果 | 第55-64页 |
| 1.内皮细胞抑制实验 | 第55-57页 |
| 2.鸡胚尿囊膜实验 | 第57-59页 |
| 3.肿瘤抑制实验 | 第59-64页 |
| 四、讨论 | 第64-67页 |
| 小结 | 第67-68页 |
| 展望 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-74页 |
| 综述 | 第74-100页 |
| 附录 | 第100-113页 |
| 作者简介 | 第113-114页 |
| 致谢 | 第114-115页 |
| 勘误表: | 第115页 |
