| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 缩写词 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-30页 |
| 1 抗生素概述 | 第14-30页 |
| 1.1 抗生素的发现与发展 | 第14页 |
| 1.2 抗生素的分类 | 第14-15页 |
| 1.3 抗生素的制备 | 第15页 |
| 1.4 β-内酰胺抗生素 | 第15-16页 |
| 1.5 β-内酰胺类抗生素的酶法合成 | 第16-19页 |
| 1.5.1 关键中间体6-氨基青霉烷酸(6-APA)的生产 | 第16-18页 |
| 1.5.2 青霉素V与青霉素G | 第18-19页 |
| 1.6 PVA | 第19-22页 |
| 1.6.1 青霉素V酰化酶(PVA)的来源 | 第19-20页 |
| 1.6.2 PVA的蛋白结构组成 | 第20页 |
| 1.6.3 PVA的性质研究 | 第20-22页 |
| 1.7 PGA | 第22-27页 |
| 1.7.1 PGA研究进展情况 | 第22-24页 |
| 1.7.2 PGA的来源 | 第24-25页 |
| 1.7.3 PGA的蛋白结构 | 第25-26页 |
| 1.7.4 合成用PGA的蛋白质工程改造 | 第26-27页 |
| 1.8 本研究的目的意义、内容与技术路线 | 第27-30页 |
| 1.8.1 本研究的目的意义 | 第27-28页 |
| 1.8.2 研究内容与技术路线 | 第28-30页 |
| 第二章 青霉素V酰化酶(BsPVA)基因的克隆、表达及定向进化的研究 | 第30-55页 |
| 2.1 实验材料 | 第31-33页 |
| 2.1.1 试剂 | 第31页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第31-32页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第32-33页 |
| 2.1.4 培养基、抗生素配置 | 第33页 |
| 2.2 实验方法 | 第33-43页 |
| 2.2.1 球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)来源的PVA (BsPVA)全基因的合成 | 第33-34页 |
| 2.2.2 BsPVA原核表达载体的构建 | 第34-35页 |
| 2.2.3 BsPVA的原核表达分析 | 第35-36页 |
| 2.2.4 BsPVA活力的检测与分析 | 第36-37页 |
| 2.2.5 BsPVA的定向进化研究 | 第37-40页 |
| 2.2.6 BsPVA的分离纯化研究 | 第40-41页 |
| 2.2.7 温度、pH值对BsPVA活力及稳定性的影响 | 第41页 |
| 2.2.8 BsPVA同源建模研究 | 第41页 |
| 2.2.9 BsPVA催化生产6-APA | 第41页 |
| 2.2.10 BsPVA的固定化研究 | 第41-43页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第43-52页 |
| 2.3.1 BsPVA原核表达菌株的构建与分析 | 第43页 |
| 2.3.2 BsPVA基因序列及氨基酸序列分析 | 第43-45页 |
| 2.3.3 BsPVA突变文库的构建 | 第45页 |
| 2.3.4 BsPVA突变文库的筛选 | 第45-46页 |
| 2.3.5 BsPVA蛋白表达与纯化分析 | 第46-47页 |
| 2.3.6 动力学常数分析 | 第47页 |
| 2.3.7 pH、温度对酶活及稳定性的影响 | 第47-49页 |
| 2.3.8 BsPVA三维模型结构对比分析 | 第49-50页 |
| 2.3.9 BsPVA催化生产6-APA | 第50-51页 |
| 2.3.10 BsPVA以及突变体BsPVA-3固定化酶研究 | 第51-52页 |
| 2.4 小结与讨论 | 第52-55页 |
| 2.4.1 小结 | 第52-53页 |
| 2.4.2 讨论 | 第53-55页 |
| 第三章 青霉素G酰化酶(PGA)基因的克隆、表达及定向进化研究 | 第55-78页 |
| 3.1 实验材料 | 第56-58页 |
| 3.1.1 所用试剂 | 第56页 |
| 3.1.2 菌株与质粒 | 第56页 |
| 3.1.3 所用仪器设备 | 第56页 |
| 3.1.4 培养基、抗生素配置 | 第56-58页 |
| 3.2 实验方法 | 第58-66页 |
| 3.2.1 木糖氧化无色杆菌来源PGA(SPGA)基因的合成 | 第58页 |
| 3.2.2 SPGA原核表达载体的构建 | 第58-59页 |
| 3.2.3 SPGA基因的原核表达分析 | 第59页 |
| 3.2.4 SPGA合成活力的检测与分析 | 第59-61页 |
| 3.2.5 SPGA水解活力的检测与分析 | 第61-63页 |
| 3.2.6 SPGA的同源模拟分析 | 第63页 |
| 3.2.7 SPGA的定向进化研究 | 第63-65页 |
| 3.2.8 SPGA的分离纯化研究 | 第65-66页 |
| 3.2.9 SPGA的固定化研究 | 第66页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第66-75页 |
| 3.3.1 表达载体的构建与分析 | 第66-67页 |
| 3.3.2 SPGA的序列分析 | 第67-70页 |
| 3.3.3 SPGA的蛋白表达分析 | 第70-71页 |
| 3.3.4 SPGA的同源建模研究 | 第71-72页 |
| 3.3.5 SPGA定向进化研究 | 第72-74页 |
| 3.3.6 SPGA突变体固定化酶性质研究 | 第74-75页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第75-78页 |
| 3.4.1 小结 | 第75-76页 |
| 3.4.2 讨论 | 第76-78页 |
| 第四章 全水相酶法催化生产半合成抗生素-阿莫西林的工艺研究 | 第78-89页 |
| 4.1 实验材料 | 第80页 |
| 4.1.1 所用试剂 | 第80页 |
| 4.1.2 实验设备 | 第80页 |
| 4.2 全水相中一锅法合成阿莫西林的反应条件优化 | 第80-82页 |
| 4.2.1 PVA不同投酶量对青霉素V钾裂解的研究 | 第80页 |
| 4.2.2 苯氧乙酸与6-APA的层析分离及6-APA质量监测 | 第80-81页 |
| 4.2.3 阿莫西林的酶法合成 | 第81-82页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第82-87页 |
| 4.3.1 不同的投酶量对青霉素V钾盐的裂解影响 | 第82-83页 |
| 4.3.2 青霉素V钾盐裂解生成6-APA质量分析 | 第83页 |
| 4.3.3 温度对阿莫西林合成反应的影响 | 第83-84页 |
| 4.3.4 pH对阿莫西林合成反应的影响 | 第84-85页 |
| 4.3.5 反应过程中pH值调整对阿莫西林合成的影响 | 第85页 |
| 4.3.6 不同浓度的D-对羟基苯甘氨酸甲酯(D-HPM)对阿莫西林合成的影响 | 第85-86页 |
| 4.3.7 全水相法合成阿莫西林批次验证实验 | 第86-87页 |
| 4.4 小结 | 第87-89页 |
| 第五章 结论、创新与展望 | 第89-92页 |
| 5.1 结论 | 第89-90页 |
| 5.2 创新 | 第90页 |
| 5.3 展望 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-106页 |
| 附录A 球形芽孢杆菌来源的PVA全基因合成序列 | 第106-107页 |
| 附录B 无色木糖氧化杆菌来源的PGA全基因合成序列 | 第107-109页 |
| 附录C 攻读博士学位期间的主要学术成果 | 第109-112页 |
| 致谢 | 第112页 |
