| 英文缩写词表 | 第3-5页 |
| 摘要 | 第5-8页 |
| Abstract | 第8-11页 |
| 第一章 引言 | 第17-35页 |
| 1. PGRN的结构及基因定位 | 第17-20页 |
| 1.1 PGRN的结构 | 第17-19页 |
| 1.2 PGRN的基因定位 | 第19-20页 |
| 2. PGRN在组织中的分布 | 第20页 |
| 3. PGRN基因表达的调控 | 第20-21页 |
| 4. PGRN的生物学功能 | 第21-23页 |
| 4.1 PGRN在损伤修复中的作用 | 第21-22页 |
| 4.2 PGRN在炎症反应中的作用 | 第22页 |
| 4.3 PGRN在生长发育中的作用 | 第22-23页 |
| 5. PGRN在中枢神经系统中的作用 | 第23页 |
| 6. PGRN相互作用的蛋白质分子 | 第23-25页 |
| 7. PGRN高表达与肿瘤发生 | 第25-27页 |
| 7.1 PGRN与肿瘤细胞的增殖 | 第25页 |
| 7.2 PGRN与肿瘤细胞的新血管生成 | 第25-26页 |
| 7.3 PGRN与肿瘤细胞的浸润性 | 第26页 |
| 7.4 PGRN与肿瘤细胞的恶性程度 | 第26-27页 |
| 8. PGRN突变与额颞叶变性(FTLD) | 第27-30页 |
| 8.1 FTLD概述 | 第27-28页 |
| 8.2 FTLD的致病基因 | 第28页 |
| 8.3 PGRN突变与FTLD-U的发生 | 第28-29页 |
| 8.4 PGRN突变与TDP-43聚积的关系 | 第29-30页 |
| 9. 结语 | 第30页 |
| 10. 课题研究意义 | 第30-31页 |
| 11. 课题技术路线 | 第31-35页 |
| 11.1 PGRN-6His/Flag蛋白的真核表达及纯化 | 第31-32页 |
| 11.2 PGRN单克隆抗体的制备 | 第32页 |
| 11.3 PGRN突变体的获得及对PGRN表达和功能的影响 | 第32-33页 |
| 11.4 PGRN相互作用分子的酵母双杂交筛选及验证 | 第33-35页 |
| 第二章 PGRN-6His和PGRN-Flag真核蛋白的表达纯化及PGRN单克隆抗体的制备 | 第35-61页 |
| 1. 实验材料和仪器 | 第35-38页 |
| 1.1 载体和细胞 | 第35页 |
| 1.2 主要材料和试剂 | 第35-36页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第36页 |
| 1.4 主要试剂配制 | 第36-38页 |
| 2. 实验方法 | 第38-47页 |
| 2.1 PGRN基因的克隆 | 第39-40页 |
| 2.2 大肠杆菌DH5α化学转化感受态细胞的制备 | 第40-41页 |
| 2.3 连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第41页 |
| 2.4 pGEMT/PGRN阳性克隆质粒的提取鉴定 | 第41-42页 |
| 2.5 携带人PGRN-6His/Flag重组腺病毒表达穿梭载体的构建 | 第42页 |
| 2.6 表达PGRN-6His或PGRN-Flag重组腺病毒载体的制备 | 第42-44页 |
| 2.7 PGRN-6His真核蛋白的表达与纯化 | 第44页 |
| 2.8 PGRN-Flag真核蛋白的表达与纯化 | 第44-45页 |
| 2.9 PGRN单克隆抗体的制备 | 第45页 |
| 2.10 PGRN截短体的构建 | 第45-46页 |
| 2.11 PGRN及其N末端截短体与GST融合蛋白的表达 | 第46页 |
| 2.12 免疫细胞化学技术检测 | 第46页 |
| 2.13 全细胞裂解液的制备 | 第46页 |
| 2.14 SDS-PAGE及Western blot检测 | 第46-47页 |
| 3. 实验结果 | 第47-59页 |
| 3.1 PGRN基因的克隆 | 第47-48页 |
| 3.2 携带人PGRN-6His/Flag重组腺病毒表达穿梭载体的构建 | 第48-49页 |
| 3.3 PGRN-6His真核表达蛋白的Western blot检测 | 第49页 |
| 3.4 PGRN-6His真核表达蛋白纯化后SDS-PAGE及Western blot检测 | 第49-50页 |
| 3.5 PGRN-Flag真核表达蛋白纯化后SDS-PAGE及Western blot检测 | 第50-51页 |
| 3.6 pAd5 E1-CMV-PGRN-CT(C末端截短体)和pAd5 E1-CMVH1H2-PGRN-NT(N末端截短体)的构建 | 第51-52页 |
| 3.7 PGRN及其N末端截短体与GST融合蛋白表达质粒的构建及表达 | 第52-53页 |
| 3.8 PGRN单克隆抗体的Western blot和免疫细胞化学技术检测 | 第53-55页 |
| 3.9 PGRN单克隆抗体识别PGRN功能域的初步鉴定 | 第55-59页 |
| 3.10 PGRN单克隆抗体检测肿瘤细胞内源性PGRN的表达 | 第59页 |
| 4. 讨论 | 第59-61页 |
| 第三章 PGRN突变体的构建、表达及其功能研究 | 第61-83页 |
| 1. 实验材料和仪器 | 第61-63页 |
| 1.1 质粒载体和细胞 | 第61页 |
| 1.2 主要材料和试剂 | 第61-62页 |
| 1.3 主要溶液配制 | 第62页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第62-63页 |
| 2. 实验方法 | 第63-69页 |
| 2.1 PGRN基因定点突变体的构建 | 第63-66页 |
| 2.2 RT-PCR检测各PGRN突变体的表达水平 | 第66-68页 |
| 2.3 Western blot检测各PGRN突变体的表达 | 第68-69页 |
| 2.4 PGRN突变体的细胞免疫荧光染色检测 | 第69页 |
| 2.5 MTT法检测PGRN突变体的细胞生长调节活性 | 第69页 |
| 3. 实验结果 | 第69-79页 |
| 3.1 PGRN突变体的构建 | 第69-75页 |
| 3.2 RT-PCR检测各PGRN突变体mRNA的表达水平 | 第75页 |
| 3.3 Western blot检测错义突变对PGRN表达和分泌的影响 | 第75-77页 |
| 3.4 PGRN单点突变蛋白的免疫荧光细胞染色检测 | 第77-79页 |
| 3.5 MTT法检测PGRN突变体的细胞生长调节活性 | 第79页 |
| 4. 讨论 | 第79-83页 |
| 第四章 利用酵母双杂交筛选与PGRN相互作用的蛋白分子 | 第83-107页 |
| 1. 实验材料和仪器 | 第85-90页 |
| 1.1 质粒和菌株 | 第85-86页 |
| 1.2 主要试剂 | 第86-87页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第87-90页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第90页 |
| 2. 实验方法 | 第90-97页 |
| 2.1 PGBKT7/PGRN酵母双杂交诱饵载体的构建、自激活检测及其对酵母细胞毒性的检测 | 第90-94页 |
| 2.2 Matchmaker GAL4 cDNA文库质粒大量制备及插入片段多样性检测 | 第94-95页 |
| 2.3 cDNA文库质粒的转化和PGRN相互作用分子的酵母双杂交筛选 | 第95-97页 |
| 3. 结果 | 第97-102页 |
| 3.1 pGBKT7/PGRN酵母诱饵载体质粒的构建与鉴定 | 第97-98页 |
| 3.2 Western blot检测诱饵蛋白在酵母菌AH109中的表达 | 第98-99页 |
| 3.3 诱饵蛋白的自激活性检测 | 第99-100页 |
| 3.4 诱饵蛋白对酵母菌AH109的细胞毒性检测 | 第100页 |
| 3.5 Human Leukocyte Matchmaker cDNA文库质粒插入片段大小多样性检测 | 第100-101页 |
| 3.6 共转化子的高严谨性筛选及阳性克隆的酶切鉴定 | 第101-102页 |
| 3.7 候选阳性克隆的测序结果 | 第102页 |
| 4. 讨论 | 第102-107页 |
| 第五章 PGRN与FAM76B蛋白相互作用的进一步验证及结合部位的确定 | 第107-137页 |
| 1. 实验材料和仪器 | 第107-108页 |
| 1.1 质粒与细胞 | 第107页 |
| 1.2 主要试剂的配制 | 第107-108页 |
| 1.3 所用仪器 | 第108页 |
| 2. 实验方法 | 第108-121页 |
| 2.1 酵母双杂交验证PGRN与FAM76B在酵母细胞内的相互作用 | 第108-111页 |
| 2.2 PGRN与FAM76B结合部位的分析鉴定 | 第111-116页 |
| 2.3 免疫共沉淀法检测PGRN和FAM76B两种蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用 | 第116-118页 |
| 2.4 GST-pull down检测PGRN和FAM76B蛋白在体外的相互作用 | 第118-120页 |
| 2.5 FAM76A, Cyclin T1, Hand1, KRTAP4-12和IL-24-His-repeat酵母表达载体的构建及酵母双杂交检测 | 第120页 |
| 2.6 PGRN突变体与FAM76B相互作用的酵母双杂交检测 | 第120-121页 |
| 2.7 激光共聚焦检测PGRN及其截短体与FAM76B的细胞共定位 | 第121页 |
| 3. 实验结果 | 第121-134页 |
| 3.1 pGADT7/FAM76B酵母表达载体的构建 | 第121-122页 |
| 3.2 pGADT7/FAM76B与pGBKT7/PGRN酵母双杂交验证 | 第122-123页 |
| 3.3 酵母双杂交筛选PGRN与FAM76B二者相互作用的结合位点 | 第123-125页 |
| 3.4 免疫共沉淀鉴定PGRN与FAM76B在哺乳动物细胞内的相互作用 | 第125-126页 |
| 3.5 GST-pull down检测PGRN和FAM76B蛋白在体外的相互作用 | 第126-128页 |
| 3.6 FAM76A,Cyclin T1,Hand1,KRTAP4-12和IL-24-His repeat五个蛋白分子酵母表达载体的构建及相关的酵母双杂交系统分析 | 第128-130页 |
| 3.7 激光共聚焦对FAM76B与PGRN/Grns的亚细胞共定位分析 | 第130-133页 |
| 3.8 PGRN突变体与FAM76B相互作用的酵母双杂交检测 | 第133-134页 |
| 4. 讨论 | 第134-137页 |
| 结论 | 第137-139页 |
| 参考文献 | 第139-151页 |
| 附录 | 第151-163页 |
| 致谢 | 第163-165页 |
| 攻读博士学位期间科研成果 | 第165页 |
