| 摘要 | 第5-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 缩写词中英文对照 | 第14-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-21页 |
| 1.1 2型糖尿病研究进展 | 第15-16页 |
| 1.1.1 糖尿病概述 | 第15-16页 |
| 1.2 GIP基因简介 | 第16-17页 |
| 1.2.1 GIP的分子结构与功能 | 第16页 |
| 1.2.2 GIP与2型糖尿病的关系 | 第16-17页 |
| 1.3 GIPR基因简介 | 第17-18页 |
| 1.3.1 GIPR的分子结构 | 第17页 |
| 1.3.2 GIPR基因的表达与调控 | 第17-18页 |
| 1.3.3 GIP/GIPR/PKA信号通路 | 第18页 |
| 1.4 2型糖尿病动物模型 | 第18-19页 |
| 1.5 本研究的目的意义 | 第19-21页 |
| 第二章 大鼠胰岛素启动子克隆与功能验证 | 第21-34页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-22页 |
| 2.1.1 材料 | 第21页 |
| 2.1.2 主要试剂及来源 | 第21-22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-26页 |
| 2.2.1 大鼠DNA提取 | 第22页 |
| 2.2.2 引物的设计与合成 | 第22页 |
| 2.2.3 RIP2启动子PCR扩增 | 第22页 |
| 2.2.4 目的片段连接pMD18-T载体 | 第22页 |
| 2.2.5 重组质粒的转化 | 第22页 |
| 2.2.6 重组质粒的PCR鉴定和测序鉴定 | 第22-23页 |
| 2.2.7 质粒的双酶切 | 第23页 |
| 2.2.8 双酶切产物的纯化 | 第23页 |
| 2.2.9 胶回收产物的T4连接 | 第23-24页 |
| 2.2.10 重组质粒的转化、细菌转化子的筛选 | 第24页 |
| 2.2.11 重组质粒的双酶切鉴定 | 第24页 |
| 2.2.12 去内毒素质粒的提取 | 第24页 |
| 2.2.13 PK-15、C2C12及βTC-6细胞的复苏、冻存与传代培养 | 第24-25页 |
| 2.2.14 重组质粒转染细胞 | 第25-26页 |
| 2.3 结果与分析 | 第26-32页 |
| 2.3.1 大鼠DNA提取结果 | 第26页 |
| 2.3.2 PCR扩增结果 | 第26-27页 |
| 2.3.3 PMD18-T-RIP2重组质粒鉴定结果 | 第27-28页 |
| 2.3.4 RIP2的启动子核心序列分析 | 第28-29页 |
| 2.3.5 PMD18-T-RIP2双酶切结果 | 第29-30页 |
| 2.3.6 EGFP-RIP2重组质粒鉴定结果 | 第30页 |
| 2.3.7 重组质粒质量检测结果 | 第30页 |
| 2.3.8 转染前细胞形态 | 第30-31页 |
| 2.3.9 细胞转染结果检测 | 第31-32页 |
| 2.4 讨论 | 第32-33页 |
| 2.4.1 启动子特征及克隆方法 | 第32页 |
| 2.4.2 INS启动子 | 第32-33页 |
| 2.5 小结 | 第33-34页 |
| 第三章 携带GIPR~(dn)和GIPR基因慢病毒的制备 | 第34-52页 |
| 3.1 实验材料 | 第34页 |
| 3.1.1 主要试剂及来源 | 第34页 |
| 3.2 实验方法 | 第34-39页 |
| 3.2.1 人GIPR~(dn)及GIPR基因序列的合成 | 第34-35页 |
| 3.2.2 引物设计合成 | 第35页 |
| 3.2.3 人GIPR~(dn)及GIPR基因扩增 | 第35页 |
| 3.2.4 PCR产物的回收纯化 | 第35页 |
| 3.2.5 目的片段与T载体的连接 | 第35页 |
| 3.2.6 重组质粒转化细菌及阳性克隆的筛选 | 第35页 |
| 3.2.7 重组质粒的测序鉴定 | 第35-36页 |
| 3.2.8 pMD18-T-GIPR~(dn)、pMD18-T-GIPR和pLV载体的双酶切 | 第36页 |
| 3.2.9 双酶切产物的纯化 | 第36页 |
| 3.2.10 胶回收产物的T4连接 | 第36页 |
| 3.2.11 重组质粒的转化、细菌转化子的筛选 | 第36页 |
| 3.2.12 pLV-RIP2-GIPR~(dn)和pLV-RIP2-GIPR重组载体的构建 | 第36-37页 |
| 3.2.13 去内毒素质粒提取 | 第37页 |
| 3.2.14 重组质粒转染βTC-6细胞 | 第37页 |
| 3.2.15 荧光显微镜观察 | 第37页 |
| 3.2.16 慢病毒的包装 | 第37-38页 |
| 3.2.17 慢病毒的收集和浓缩 | 第38页 |
| 3.2.18 滴度测定 | 第38页 |
| 3.2.19 病毒感染3TC-6细胞 | 第38页 |
| 3.2.20 细胞总RNA提取 | 第38页 |
| 3.2.21 PCR扩增GIPR~(dn)和GIPR基因的cDNA | 第38-39页 |
| 3.3 结果与分析 | 第39-50页 |
| 3.3.1 GIPR~(dn)和GIPR的PCR扩增结果 | 第39-40页 |
| 3.3.2 pMD18-T-GIPR~(dn)、pMD18-T-GIPR和pLV双酶切结果 | 第40-41页 |
| 3.3.3 pLV-GIPR~(dn)、 pLV-GIPR重组质粒鉴定结果 | 第41-45页 |
| 3.3.4 RIP2、 pLV-GIPR~(dn)、 pLV-GIPR的双酶切 | 第45页 |
| 3.3.5 pLV-RIP2-GIPR~(dn)、 pLV-RIP2-GIPR的菌液PCR验证 | 第45-46页 |
| 3.3.6 pLV-RIP2-GIPR~(dn)、pLV-RIP2-GIPR双酶切鉴定 | 第46-47页 |
| 3.3.7 pLV-GIPR~(dn)、pLV-GIPR转染βTC-6细胞结果 | 第47-48页 |
| 3.3.8 pLV-RIP2-GIPR~(dn)、pLV-RIP2-GIPR转染βTC-6细胞结果 | 第48页 |
| 3.3.9 病毒包装及病毒滴度检测 | 第48-49页 |
| 3.3.10 慢病毒感染βTC-6细胞 | 第49-50页 |
| 3.3.11 细胞cDNA的PCR结果 | 第50页 |
| 3.4 讨论 | 第50-51页 |
| 3.4.1 慢病毒载体 | 第50-51页 |
| 3.4.2 慢病毒的包装 | 第51页 |
| 3.5 小结 | 第51-52页 |
| 第四章 GIPR~(dn)和GIPR过表达对βTC-6细胞胰岛素分泌的影响 | 第52-65页 |
| 4.1 实验材料 | 第52-54页 |
| 4.1.1 主要仪器 | 第52-53页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第53页 |
| 4.1.3 主要溶液配制 | 第53-54页 |
| 4.2 实验方法 | 第54-58页 |
| 4.2.1 定量引物设计 | 第54-55页 |
| 4.2.2 PCR扩增目的片段 | 第55页 |
| 4.2.3 目的片段克隆至pMD18-T载体 | 第55页 |
| 4.2.4 标准曲线制作 | 第55页 |
| 4.2.5 去内毒素质粒的提取和慢病毒制备 | 第55-56页 |
| 4.2.6 慢病毒感染βTC-6细胞 | 第56页 |
| 4.2.7 提取细胞总RNA反转录为cDNA | 第56-57页 |
| 4.2.8 实时荧光定量PCR | 第57页 |
| 4.2.9 蛋白样品制备 | 第57页 |
| 4.2.10 蛋白浓度测定 | 第57页 |
| 4.2.11 Western Blot检测蛋白 | 第57-58页 |
| 4.2.12 ELISA测定细胞培养基胰岛素浓度 | 第58页 |
| 4.3 结果与分析 | 第58-62页 |
| 4.3.1 病毒感染βTC-6细胞各个基因相对表达结果 | 第58-59页 |
| 4.3.2 蛋白浓度测定结果 | 第59-60页 |
| 4.3.3 蛋白表达的SDS-PAGE分析结果 | 第60页 |
| 4.3.4 蛋白的Western Blot检测结果 | 第60-62页 |
| 4.3.5 培养基中胰岛素浓度测定结果 | 第62页 |
| 4.4 讨论 | 第62-64页 |
| 4.5 小结 | 第64-65页 |
| 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-73页 |
| 附录 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第75页 |
