| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| Table of Contents | 第9-13页 |
| Abbreviations | 第13-16页 |
| Chapter 1 Introduction | 第16-42页 |
| 1.1 Historical Background | 第16-17页 |
| 1.2 Symptoms | 第17-18页 |
| 1.3 Genome | 第18-20页 |
| 1.4 Protein Expression System | 第20页 |
| 1.5 Dengue Diagnosis | 第20-23页 |
| 1.5.1 Current Protocols for the Diagnosis of Dengue Infections | 第21-22页 |
| 1.5.1.1 Serological Detection | 第21页 |
| 1.5.1.2 Virus Detection | 第21-22页 |
| 1.5.1.3 Antigen Detection | 第22页 |
| 1.5.1.4 Genome Detection | 第22页 |
| 1.5.1.5 Main Problems for Dengue Detection | 第22页 |
| 1.5.2 Requirements for Better Diagnosis | 第22-23页 |
| 1.6 Immunoglobulins, A Universal Tool | 第23-32页 |
| 1.6.1 Antibody Structure | 第23-24页 |
| 1.6.2 IMGT Unique Numbering System | 第24-25页 |
| 1.6.3 Surface Plasmon Resonance (SPR) | 第25-27页 |
| 1.6.4 Monoclonal Antibody (MAb) | 第27-28页 |
| 1.6.5 Nanobodies (VHH Antibodies) | 第28-32页 |
| 1.6.5.1 Increased Solubility | 第30页 |
| 1.6.5.2 Tissue Penetration | 第30页 |
| 1.6.5.3 Targeting Cryptic Epitopes / Enzyme Inhibitor | 第30-31页 |
| 1.6.5.4 Low Immunogenicity | 第31页 |
| 1.6.5.5 VHH Antibodies Preparation | 第31-32页 |
| 1.7 Phage Display Technology | 第32-35页 |
| 1.8 Epitope Mapping | 第35-38页 |
| 1.9 Development of Rapid Diagnostic Kit | 第38-41页 |
| 1.10 Main Objectives for Present Study | 第41-42页 |
| Chapter 2 Development of Dengue type 2 Recombinant NS1 Antigen | 第42-59页 |
| 2.1 Introduction | 第42-44页 |
| 2.2 Materials and Methods | 第44-51页 |
| 2.2.1 NS1 Gene Preparation | 第44-46页 |
| 2.2.1.1 TA Cloning | 第45页 |
| 2.2.1.2 Colony Culturing and Colony PCR | 第45-46页 |
| 2.2.2 Double Digestion of Plasmid and Vector | 第46页 |
| 2.2.3 Ligation and Transformation | 第46-48页 |
| 2.2.4 Colony Culturing and Colony PCR | 第48页 |
| 2.2.5 Protein Expression and Purification | 第48-49页 |
| 2.2.6 Western Blot Analysis | 第49页 |
| 2.2.7 Indirect ELISA | 第49-50页 |
| 2.2.8 Fluorescence Spectroscopy and Circular Dichroism | 第50-51页 |
| 2.3 Results | 第51-57页 |
| 2.3.1 Amplification, Cloning, Plasmid Construction and Identification of DENV2 NS1 | 第51-53页 |
| 2.3.2 Expression and Purification of the Recombinant DENV2 NS1 Protein | 第53页 |
| 2.3.3 rNS1 refolding | 第53-55页 |
| 2.3.4 Spectroscopic Analysis of rNS140 | 第55-57页 |
| 2.4 Discussion | 第57-59页 |
| Chapter 3 Development of monoclonal and VHH antibodies against rNS1: A comparison study | 第59-88页 |
| 3.1 Introduction | 第59-62页 |
| 3.2 Materials and Methods | 第62-73页 |
| 3.2.1 Preparation of Monoclonal Antibody | 第62-65页 |
| 3.2.1.1 Indirect ELISA to Analyze the Sera of Mice | 第62页 |
| 3.2.1.2 Cell Fusion | 第62-63页 |
| 3.2.1.3 Screening of clones | 第63页 |
| 3.2.1.4 Limited Dilution | 第63页 |
| 3.2.1.5 Amplification and Preservation of Clones | 第63页 |
| 3.2.1.6 Ascites and Monoclonal Antibody Production | 第63-64页 |
| 3.2.1.7 Activity of Ascites and anti-rNS1 Monoclonal Antibodies | 第64页 |
| 3.2.1.8 SDS-PAGE and Western Blot Analysis | 第64-65页 |
| 3.2.2 Construction of Non-Immune Llama Library | 第65页 |
| 3.2.3 Llama Heavy Chain Antibody Screening | 第65-72页 |
| 3.2.3.1 M13K07 Phage Proliferation | 第65-66页 |
| 3.2.3.2 Phage Titration | 第66页 |
| 3.2.3.3 VHH Antibody Screening | 第66-67页 |
| 3.2.3.4 Phage Binding Analysis | 第67页 |
| 3.2.3.5 Sequence Analysis of Plasmids (pCANTAB5E-VHH) | 第67页 |
| 3.2.3.6 Purification and Double Digestion of Plasmids (pCANTAB5E-VHH) and Vectors | 第67-68页 |
| 3.2.3.7 Ligation and Transformation | 第68-69页 |
| 3.2.3.8 VHH Antibody Expression and Purification | 第69-72页 |
| 3.2.4 Surface Plasmon Resonance of VHH and Monoclonal antibodies | 第72-73页 |
| 3.3 Results | 第73-84页 |
| 3.3.1 Development of Monoclonal Antibody | 第73-77页 |
| 3.3.2 Development of VHH antibody | 第77-81页 |
| 3.3.3 Binding Affinity Analysis of VHH and Monoclonal Antibodies | 第81-84页 |
| 3.4 Discussion | 第84-88页 |
| Chapter 4 Epitope Mapping of VHH and Monoclonal Antibodies | 第88-101页 |
| 4.1 Introduction | 第88-91页 |
| 4.2 Materials and Methods | 第91-94页 |
| 4.2.1 Phage Titering | 第91-92页 |
| 4.2.2 Surface Panning Procedure (Direct target Coating) | 第92页 |
| 4.2.3 Plaque Amplification for Sequencing | 第92-93页 |
| 4.2.4 Rapid Purification of Sequencing Templates for Sequencing of Phage DNA | 第93页 |
| 4.2.5 Sequencing Guidelines | 第93-94页 |
| 4.3 Results | 第94-98页 |
| 4.4 Discussion | 第98-101页 |
| Chapter 5 Development and comparison study of VHH and Monoclonal Antibodies Immobilized Rapid Diagnostic Kits | 第101-113页 |
| 5.1 Introduction | 第101-104页 |
| 5.2 Materials and Methods | 第104-106页 |
| 5.2.1 Synthesis of Colloidal Gold for Rapid Diagnostic Test | 第104页 |
| 5.2.2 Test Strip Preparation | 第104-105页 |
| 5.2.3 Principle of Immunochromatographic Lateral-Flow Test Strip | 第105-106页 |
| 5.3 Results | 第106-110页 |
| 5.4 Discussion | 第110-113页 |
| Conclusions | 第113-116页 |
| References | 第116-138页 |
| Appendix | 第138-146页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第146-147页 |
| Acknowledgements | 第147-148页 |
| 附件 | 第148页 |
