| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 缩略词表 | 第9-10页 |
| 目录 | 第10-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-47页 |
| 1.1 引言 | 第15-16页 |
| 1.2 尼古丁的微生物降解简介 | 第16-33页 |
| 1.2.1 尼古丁微生物降解的途径 | 第16-19页 |
| 1.2.2 微生物降解尼古丁的生化机制研究 | 第19-27页 |
| 1.2.3 已报导关于尼古丁微生物降解相关酶的结构生物学研究进展 | 第27-33页 |
| 1.3 结构生物学简介 | 第33-45页 |
| 1.3.1 结构生物学在酶学研究中的意义 | 第33-35页 |
| 1.3.2 X 射线衍射法结构生物学研究 | 第35-41页 |
| 1.3.3 NMR 法、电镜法简介 | 第41-45页 |
| 1.4 课题研究意义 | 第45-47页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第47-64页 |
| 2.1 实验材料 | 第47-50页 |
| 2.1.1 菌株 | 第47页 |
| 2.1.2 质粒 | 第47-48页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第48-49页 |
| 2.1.4 常规试剂 | 第49-50页 |
| 2.2 常用溶液及试剂配制 | 第50-52页 |
| 2.2.1 常用溶液配制 | 第50-51页 |
| 2.2.2 常用试剂配制 | 第51-52页 |
| 2.3 实验方法 | 第52-64页 |
| 2.3.1 蛋白质结构预测的生物信息学方法 | 第52-53页 |
| 2.3.2 引物设计及片段扩增 | 第53页 |
| 2.3.3 载体和片段酶切 | 第53-54页 |
| 2.3.4 载体和片段连接 | 第54页 |
| 2.3.5 连接产物转化 | 第54页 |
| 2.3.6 阳性克隆鉴定 | 第54-55页 |
| 2.3.7 突变体的构建 | 第55-56页 |
| 2.3.8 蛋白小规模表达测试 | 第56页 |
| 2.3.9 蛋白大规模表达 | 第56-57页 |
| 2.3.10 蛋白提取 | 第57-58页 |
| 2.3.11 分子筛层析纯化 | 第58-59页 |
| 2.3.12 蛋白结晶及晶体筛选和优化 | 第59-60页 |
| 2.3.13 复合物的制备 | 第60-61页 |
| 2.3.14 X 射线衍射数据收集和处理 | 第61页 |
| 2.3.15 结构解析和修正 | 第61-62页 |
| 2.3.16 酶活性动力学分析检测 | 第62-64页 |
| 第三章 Nfo 结构解析及功能分析 | 第64-97页 |
| 3.1 实验材料和方法 | 第64-74页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第64页 |
| 3.1.2 Nfo 野生型及各突变体载体构建 | 第64-66页 |
| 3.1.3 Nfo 蛋白表达和纯化 | 第66-67页 |
| 3.1.4 Nfo 硒代蛋白的制备 | 第67-68页 |
| 3.1.5 Nfo 晶体筛选和优化 | 第68-70页 |
| 3.1.6 Se-Met-Nfo(S94A)衍射数据收集和晶体结构解析 | 第70页 |
| 3.1.7 Nfo(S94A)与 NFM 分子对接 | 第70-71页 |
| 3.1.8 Nfo 结构与功能关系分析 | 第71-72页 |
| 3.1.9 偶联法测定 Nfo 酶活的原理及试剂配制 | 第72-73页 |
| 3.1.10 Hpo 与 DHP 反应制备 NFM | 第73-74页 |
| 3.1.11 Nfo(WT)及各突变体与 Fdh 偶联测定酶活 | 第74页 |
| 3.2 结果与讨论 | 第74-95页 |
| 3.2.1 Nfo 结构预测及同源比对 | 第74-75页 |
| 3.2.2 Nfo 蛋白表达纯化 | 第75-76页 |
| 3.2.3 Se-Met-Nfo(S94A)晶体筛选和优化 | 第76-79页 |
| 3.2.4 Nfo(S94A)与底物（或产物）共结晶实验 | 第79-80页 |
| 3.2.5 Se-Met-Nfo-(S94A)结构解析 | 第80-83页 |
| 3.2.6 Nfo(S94A)整体结构分析 | 第83页 |
| 3.2.7 Nfo 所属α/β蛋白酶家族结构分析 | 第83-85页 |
| 3.2.8 Nfo(S94A)底物结合位点分析 | 第85-87页 |
| 3.2.9 Nfo(S94A)与底物 NFM 的分子对接模拟及关键氨基酸位点分析 | 第87-89页 |
| 3.2.10 突变体蛋白的表达与纯化 | 第89-91页 |
| 3.2.11 NFM 的制备 | 第91页 |
| 3.2.12 Nfo 及各突变体对 NFM 反应活性的研究 | 第91-93页 |
| 3.2.13 Nfo(WT)及各突变体酶动力学常数的测定 | 第93-95页 |
| 3.4 本章小结 | 第95-97页 |
| 第四章 Ami (C149A)突变体与马来酸的复合物的结构解析及底物选择性分析 | 第97-128页 |
| 4.1 实验材料与方法 | 第97-103页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第97页 |
| 4.1.2 Ami 各突变体构建及蛋白提取 | 第97-99页 |
| 4.1.3 Ami(C149A)与马来酰胺酸共结晶的筛选和优化 | 第99-100页 |
| 4.1.4 晶体结构解析 | 第100页 |
| 4.1.5 Ami 野生型及关键点突变体酶活测定原理 | 第100-101页 |
| 4.1.6 偶联法测定 Ami 酶活相关试剂配制 | 第101-102页 |
| 4.1.7 偶联法酶活测定体系 | 第102页 |
| 4.1.8 通过分子对接分析揭示 Nfo，Ami 底物特异性的分子机理 | 第102-103页 |
| 4.2 实验结果与讨论 | 第103-121页 |
| 4.2.1 蛋白提取与纯化 | 第103-104页 |
| 4.2.2 Ami(C149A)与底物马来酰胺酸共结晶的筛选和优化 | 第104-106页 |
| 4.2.3 Ami(C149A)/马来酸共结晶结构解析 | 第106-107页 |
| 4.2.4 Ami(C149A)/马来酸复合物整体结构分析 | 第107-110页 |
| 4.2.5 Ami 与其同源酰胺酶具有高度的序列和结构相似性 | 第110-111页 |
| 4.2.6 Ami 及其同源酰胺酶具有底物选择特异性 | 第111-113页 |
| 4.2.7 Ami 及其同源酰胺酶底物选择特异性的原因 | 第113-116页 |
| 4.2.8 Ami 突变体蛋白的提取 | 第116-117页 |
| 4.2.9 Ami 各突变体酶活测定 | 第117-120页 |
| 4.2.10 Ami 结构及催化机制分析 | 第120-121页 |
| 4.3 Nfo (WT)、Ami (WT)分别对 NFM、马来酰胺酸催化特异性的研究 | 第121-126页 |
| 4.3.1 Nfo (WT)、Ami (WT)分别对 NFM 的催化活性研究 | 第121-122页 |
| 4.3.2 Nfo(WT)、Ami(WT)分别对马来酰胺酸催化活性的研究 | 第122-123页 |
| 4.3.3 Nfo 对 NFM 和马来酰胺酸选择特异性的分子机理分析 | 第123-125页 |
| 4.3.4 Ami 对马来酰胺酸和 NFM 选择特异性的分子机理探讨 | 第125-126页 |
| 4.4 本章小结 | 第126-128页 |
| 第五章 Pp-Iso 的 C200A 突变体与底物马来酸的复合物的晶体结构解析及 Pp-Iso调节底物进入的分子机理探索 | 第128-148页 |
| 5.1 实验方法 | 第128-131页 |
| 5.1.1 突变体的构建 | 第128-129页 |
| 5.1.2 蛋白提取及纯化 | 第129页 |
| 5.1.3 Pp-Iso(C200A)/马来酸复合物晶体的获得及结构解析 | 第129-130页 |
| 5.1.4 Pp-Iso 及各突变体酶活测定 | 第130页 |
| 5.1.5 分子动力学模拟探索底物马来酸进入 Pp-Iso 的机理 | 第130-131页 |
| 5.2 实验结果与讨论 | 第131-145页 |
| 5.2.1 Pp-Iso(C200A)蛋白提取与纯化 | 第131-132页 |
| 5.2.2 Pp-Iso(C200A)/马来酸复合物晶体筛选和优化 | 第132-133页 |
| 5.2.3 Pp-Iso(C200A)/马来酸复合物结构解析 | 第133-134页 |
| 5.2.4 Pp-Iso(C200A)/马来酸复合物整体结构分析 | 第134-137页 |
| 5.2.5 Pp-Iso 催化机制探索及关键氨基酸位点分析 | 第137-140页 |
| 5.2.6 Pp-Iso 关键氨基酸位点突变体蛋白提取 | 第140-141页 |
| 5.2.7 Pp-Iso 关键氨基酸位点突变体酶活测定 | 第141页 |
| 5.2.8 马来酸与 Pp-Iso 结合方式分析 | 第141-143页 |
| 5.2.9 底物马来酸进入 Pp-Iso 的机理 | 第143-145页 |
| 5.2.10 各突变体酶动力学常数测定 | 第145页 |
| 5.3 本章小结 | 第145-148页 |
| 总结 | 第148-150页 |
| 创新点分析 | 第150-152页 |
| 参考文献 | 第152-165页 |
| 致谢 | 第165-167页 |
| 博士期间发表论文 | 第167页 |
