| 符号说明 | 第4-10页 |
| 中文摘要 | 第10-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第13-25页 |
| 1.1 非生物胁迫的危害 | 第13-15页 |
| 1.1.1 低温胁迫对植物的危害 | 第13-14页 |
| 1.1.2 干旱对植物的危害 | 第14页 |
| 1.1.3 盐胁迫对植物的危害 | 第14页 |
| 1.1.4 高温胁迫对植物的危害 | 第14-15页 |
| 1.2 植物对非生物胁迫的响应机制 | 第15-17页 |
| 1.2.1 植物应对低温胁迫 | 第15-16页 |
| 1.2.2 植物应对干旱胁迫机制 | 第16页 |
| 1.2.3 植物应对高盐胁迫机制 | 第16-17页 |
| 1.3 植物中参与应答非生物胁迫的转录因子 | 第17-23页 |
| 1.3.1 AP2/EREBP类转录因子 | 第18-20页 |
| 1.3.2 bZIP类转录因子 | 第20页 |
| 1.3.3 NAC类转录因子 | 第20-21页 |
| 1.3.4 bHLH转录因子 | 第21页 |
| 1.3.5 WRKY转录因子 | 第21-22页 |
| 1.3.6 MYB转录因子 | 第22-23页 |
| 1.3.6.1 MYB蛋白的分类 | 第22-23页 |
| 1.3.6.2 R2R3响应非生物胁迫研究进展 | 第23页 |
| 1.4 本研究的目的意义 | 第23-25页 |
| 2 材料和方法 | 第25-41页 |
| 2.1 植物材料 | 第25-27页 |
| 2.1.1 植物材料的培养和处理 | 第25页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第25页 |
| 2.1.3 酶、生化试剂、试剂盒与培养基 | 第25-26页 |
| 2.1.4 实验引物(见附录) | 第26页 |
| 2.1.5 仪器与设备 | 第26页 |
| 2.1.6 软件和网络资源 | 第26-27页 |
| 2.2 实验方法 | 第27-41页 |
| 2.2.1 总RNA的提取 | 第27-28页 |
| 2.2.1.1 苹果属植物总RNA的提取 | 第27-28页 |
| 2.2.1.2 植物组织总RNA含量以及纯度检测 | 第28页 |
| 2.2.2 RNA的纯化方法 | 第28页 |
| 2.2.3 苹果基因组DNA的提取及纯化 | 第28-30页 |
| 2.2.3.1 苹果基因组DNA的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.3.2 苹果基因组DNA的纯化 | 第29-30页 |
| 2.2.3.3 苹果基因组DNA含量以及纯度检测 | 第30页 |
| 2.2.4 cDNA第一链的合成 | 第30页 |
| 2.2.5 PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶DNA回收 | 第31-32页 |
| 2.2.7 目的片段与克隆载体的连接 | 第32页 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第32-33页 |
| 2.2.8.1 大肠杆菌DH5α感受态制备方法 | 第32页 |
| 2.2.8.2 热激法转化DH5α感受态细胞 | 第32-33页 |
| 2.2.9 筛菌、测序 | 第33页 |
| 2.2.10 质粒DNA的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.11 土壤农杆菌LBA4404感受态的制备与转化 | 第34-35页 |
| 2.2.11.1 土壤农杆菌LBA4404感受态的制备 | 第34页 |
| 2.2.11.2 土壤农杆菌LBA4404感受态的转化 | 第34-35页 |
| 2.2.12 实时荧光定量PCR | 第35页 |
| 2.2.13 MdMYB4生物信息学分析 | 第35页 |
| 2.2.14 亚细胞定位 | 第35-36页 |
| 2.2.14.1 构建表达载体 | 第35-36页 |
| 2.2.14.1.1 酶切 | 第35页 |
| 2.2.14.1.2 连接 | 第35-36页 |
| 2.2.14.2 洋葱表皮遗传转化 | 第36页 |
| 2.2.14.3 共聚焦显微镜观察 | 第36页 |
| 2.2.15 农杆菌介导的王林苹果愈伤组织遗传转化及筛选鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.15.1 王林苹果愈伤组织的培养 | 第37页 |
| 2.2.15.2 王林苹果愈伤组织的转化 | 第37页 |
| 2.2.16 蛋白质技术 | 第37-39页 |
| 2.2.16.1 原核表达诱导蛋白 | 第37页 |
| 2.2.16.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS--PAGE) | 第37-39页 |
| 2.2.17 植物总蛋白的提取 | 第39页 |
| 2.2.18 蛋白免疫印迹(Westernblotting) | 第39-41页 |
| 2.2.18.1 转膜 | 第39-40页 |
| 2.2.18.2 封闭和显影 | 第40-41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-49页 |
| 3.1 苹果基因MdMYB4的克隆与分析 | 第41-43页 |
| 3.1.1 MdMYB4基因的克隆 | 第41页 |
| 3.1.2 苹果MdMYB4的进化树及基因组结构分析 | 第41-42页 |
| 3.1.3 结构域分析 | 第42-43页 |
| 3.1.4 MdMYB4基因上游调控序列重要顺式作用元件分析 | 第43页 |
| 3.2 苹果MdMYB4亚细胞定位 | 第43-44页 |
| 3.3 原核诱导表达MdMYB4蛋白 | 第44-45页 |
| 3.3.1 原核表达载体的构建 | 第44页 |
| 3.3.2 原核表达结果 | 第44-45页 |
| 3.4 野生型王林愈伤组织在盐处理下的生长状况与MdMYB4的表达量 | 第45-46页 |
| 3.5 过表达MdMYB4基因提高王林愈伤组织对盐胁迫的抗性 | 第46-49页 |
| 3.5.1 转基因王林愈伤组织的获得与鉴定 | 第46页 |
| 3.5.2 不同浓度盐处理下王林愈伤的生长情况 | 第46-47页 |
| 3.5.3 不同NaCl浓度处理下的MdMYB4、MdSOS1、MdNHX1表达量及MdSOS1、MdNHX1启动子顺势作用元件分析 | 第47-49页 |
| 4 讨论 | 第49-52页 |
| 4.1 MdMYB4属于SG2,并且能够响应盐胁迫 | 第49页 |
| 4.2 MdMYB4受盐胁迫诱导并能够调控MdNHX1的表达 | 第49-51页 |
| 4.3 MdMYB4基因可能参与抗冷逆境 | 第51-52页 |
| 5 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-67页 |
| 附录 | 第67-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第69页 |
