| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 一 导论 | 第11-29页 |
| 1 前言 | 第11页 |
| 2 番木瓜环斑病毒(PRSV)的国内外研究现状及分析 | 第11-19页 |
| 2.1 马铃薯Y病毒属 | 第11-12页 |
| 2.2 番木瓜环斑病毒 | 第12页 |
| 2.3 症状 | 第12页 |
| 2.4 传播途径 | 第12-13页 |
| 2.5 PRSV 株系 | 第13页 |
| 2.6 病毒粒子的生物学特性 | 第13-14页 |
| 2.7 结构功能 | 第14-15页 |
| 2.8 PRSV基因组结构与功能 | 第15-19页 |
| 3 防治技术研究 | 第19-23页 |
| 3.1 番木瓜抗病育种和组培研究 | 第19页 |
| 3.2 弱株系的研究和利用 | 第19页 |
| 3.3 基因工程抗病性 | 第19-23页 |
| 4 侵染性cDNA克隆的构建 | 第23页 |
| 5 侵染性克隆在大肠杆菌(E.coli)中的稳定性 | 第23-25页 |
| 6 穿梭质粒及双元载体系统 | 第25-26页 |
| 7 酵母同源重组系统 | 第26页 |
| 8 农杆菌侵染法 | 第26页 |
| 9 本研究目的和意义 | 第26-28页 |
| 10 技术路线 | 第28-29页 |
| 二 材料与方法 | 第29-45页 |
| 1 材料 | 第29-35页 |
| 1.1 植物材料和病毒株 | 第29页 |
| 1.2 主要试剂 | 第29-30页 |
| 1.3 仪器设备 | 第30页 |
| 1.4 菌株 | 第30页 |
| 1.5 载体 | 第30-32页 |
| 1.6 培养基 | 第32页 |
| 1.7 引物 | 第32-35页 |
| 2 方法 | 第35-45页 |
| 2.1 植物总RNA的提取 | 第35页 |
| 2.2 RNA纯度及完整性检测 | 第35页 |
| 2.3 DNA第一链的合成 | 第35-36页 |
| 2.4 3'RACE | 第36-37页 |
| 2.5 5'RACE | 第37页 |
| 2.6 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) | 第37-38页 |
| 2.7 琼脂糖凝胶电泳及回收 | 第38-39页 |
| 2.8 T载体的连接反应 | 第39页 |
| 2.9 In-Fusion反应 | 第39-40页 |
| 2.10 大肠杆菌感受态细胞化学转化 | 第40页 |
| 2.11 常规的PCR反应 | 第40-41页 |
| 2.12 长片段重叠延伸PCR | 第41页 |
| 2.13 大肠杆菌质粒的提取 | 第41页 |
| 2.14 DNA测序与数据分析 | 第41-42页 |
| 2.15 酵母感受态细胞的制备 | 第42页 |
| 2.16 酵母感受态细胞的化学转化 | 第42-43页 |
| 2.17 酵母质粒的提取 | 第43页 |
| 2.18 农杆菌化学转化感受态细胞的制备 | 第43-44页 |
| 2.19 农杆菌的转化 | 第44页 |
| 2.20 注射接种 | 第44页 |
| 2.21 侵染性检测 | 第44-45页 |
| 三 结果与分析 | 第45-59页 |
| 1 番木瓜叶片提取的总RNA的凝胶电泳检测 | 第45页 |
| 2 质粒p-A、p-B、p-C、p-D的构建 | 第45-46页 |
| 3 质粒p-E、p-F的构建 | 第46-47页 |
| 4 酵母重组系统构建PRSV-HN2全长cDNA克隆载体pB-P | 第47-49页 |
| 5 酵母重组系统构建PRSV-HN2全长cDNA侵染性克隆PPH | 第49-51页 |
| 6 酵母重组系统构建带有GFP序列的PRSV-HN2全长cDNA侵染性克隆 | 第51-53页 |
| 6.1 构建P1蛋白后插入GFP序列的全长cDNA侵染性克隆PPHP1G | 第51页 |
| 6.2 构建P3蛋白后插入GFP序列的全长cDNA侵染性克隆PPHP3G | 第51-52页 |
| 6.3 构建NIB蛋白后插入GFP序列的全长cDNA侵染性克隆PPHNIBG | 第52-53页 |
| 7 PRSV-HN2全长基因组序列的测定 | 第53-54页 |
| 8 PRSV全长测序及序列分析 | 第54页 |
| 9 与己克隆公布序列核苷酸、氨基酸同源性比较及系统发育树分析 | 第54-57页 |
| 10 PRSV-HN2全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 | 第57-59页 |
| 四 讨论 | 第59-63页 |
| 1 利用RACE-PCR获得末端序列的技术改进 | 第59页 |
| 2 长片段的RT-PCR的技术要领 | 第59-60页 |
| 3 全长cDNA侵染性克隆在大肠杆菌(E.coli)中的不稳定性及解决方案 | 第60-61页 |
| 4 三种插入GFP基因的PRSV-HN2病毒表达载体的构建与表达情况 | 第61-62页 |
| 5 利用酵母同源重组系统构建PRSV全长序列的意义 | 第62页 |
| 6 PRSV-HN2分离物cDNA侵染性克隆的潜在利用价值 | 第62-63页 |
| 五 结论 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-69页 |
| 附录 | 第69-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
