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利用酵母同源重组系统构建PRSV-HN2侵染性克隆及其侵染力分析

摘要第4-6页
ABSTRACT第6-7页
一 导论第11-29页
    1 前言第11页
    2 番木瓜环斑病毒(PRSV)的国内外研究现状及分析第11-19页
        2.1 马铃薯Y病毒属第11-12页
        2.2 番木瓜环斑病毒第12页
        2.3 症状第12页
        2.4 传播途径第12-13页
        2.5 PRSV 株系第13页
        2.6 病毒粒子的生物学特性第13-14页
        2.7 结构功能第14-15页
        2.8 PRSV基因组结构与功能第15-19页
    3 防治技术研究第19-23页
        3.1 番木瓜抗病育种和组培研究第19页
        3.2 弱株系的研究和利用第19页
        3.3 基因工程抗病性第19-23页
    4 侵染性cDNA克隆的构建第23页
    5 侵染性克隆在大肠杆菌(E.coli)中的稳定性第23-25页
    6 穿梭质粒及双元载体系统第25-26页
    7 酵母同源重组系统第26页
    8 农杆菌侵染法第26页
    9 本研究目的和意义第26-28页
    10 技术路线第28-29页
二 材料与方法第29-45页
    1 材料第29-35页
        1.1 植物材料和病毒株第29页
        1.2 主要试剂第29-30页
        1.3 仪器设备第30页
        1.4 菌株第30页
        1.5 载体第30-32页
        1.6 培养基第32页
        1.7 引物第32-35页
    2 方法第35-45页
        2.1 植物总RNA的提取第35页
        2.2 RNA纯度及完整性检测第35页
        2.3 DNA第一链的合成第35-36页
        2.4 3'RACE第36-37页
        2.5 5'RACE第37页
        2.6 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)第37-38页
        2.7 琼脂糖凝胶电泳及回收第38-39页
        2.8 T载体的连接反应第39页
        2.9 In-Fusion反应第39-40页
        2.10 大肠杆菌感受态细胞化学转化第40页
        2.11 常规的PCR反应第40-41页
        2.12 长片段重叠延伸PCR第41页
        2.13 大肠杆菌质粒的提取第41页
        2.14 DNA测序与数据分析第41-42页
        2.15 酵母感受态细胞的制备第42页
        2.16 酵母感受态细胞的化学转化第42-43页
        2.17 酵母质粒的提取第43页
        2.18 农杆菌化学转化感受态细胞的制备第43-44页
        2.19 农杆菌的转化第44页
        2.20 注射接种第44页
        2.21 侵染性检测第44-45页
三 结果与分析第45-59页
    1 番木瓜叶片提取的总RNA的凝胶电泳检测第45页
    2 质粒p-A、p-B、p-C、p-D的构建第45-46页
    3 质粒p-E、p-F的构建第46-47页
    4 酵母重组系统构建PRSV-HN2全长cDNA克隆载体pB-P第47-49页
    5 酵母重组系统构建PRSV-HN2全长cDNA侵染性克隆PPH第49-51页
    6 酵母重组系统构建带有GFP序列的PRSV-HN2全长cDNA侵染性克隆第51-53页
        6.1 构建P1蛋白后插入GFP序列的全长cDNA侵染性克隆PPHP1G第51页
        6.2 构建P3蛋白后插入GFP序列的全长cDNA侵染性克隆PPHP3G第51-52页
        6.3 构建NIB蛋白后插入GFP序列的全长cDNA侵染性克隆PPHNIBG第52-53页
    7 PRSV-HN2全长基因组序列的测定第53-54页
    8 PRSV全长测序及序列分析第54页
    9 与己克隆公布序列核苷酸、氨基酸同源性比较及系统发育树分析第54-57页
    10 PRSV-HN2全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析第57-59页
四 讨论第59-63页
    1 利用RACE-PCR获得末端序列的技术改进第59页
    2 长片段的RT-PCR的技术要领第59-60页
    3 全长cDNA侵染性克隆在大肠杆菌(E.coli)中的不稳定性及解决方案第60-61页
    4 三种插入GFP基因的PRSV-HN2病毒表达载体的构建与表达情况第61-62页
    5 利用酵母同源重组系统构建PRSV全长序列的意义第62页
    6 PRSV-HN2分离物cDNA侵染性克隆的潜在利用价值第62-63页
五 结论第63-64页
参考文献第64-69页
附录第69-77页
致谢第77页

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