| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-23页 |
| 1 前言 | 第13-14页 |
| 2 miRNA的分子特征 | 第14-15页 |
| 2.1 从独立的转录单位表达 | 第14-15页 |
| 2.2 生物间的保守性 | 第15页 |
| 2.3 miRNA具有基因簇集现象 | 第15页 |
| 2.4 阶段性和组织特异性表达 | 第15页 |
| 3 miRNA的发生过程和调控机制 | 第15-16页 |
| 4 miRNA在繁殖方面的研究进展 | 第16-17页 |
| 5 线粒体基因组及其功能 | 第17-19页 |
| 6 miRNAs的研究方法和靶基因检测技术 | 第19-22页 |
| 6.1 正向遗传学筛选 | 第19-20页 |
| 6.2 定向克隆 | 第20-21页 |
| 6.2.1 组织cDNA文库法 | 第20页 |
| 6.2.2 miRNA芯片 | 第20页 |
| 6.2.3 Solexa测序技术 | 第20-21页 |
| 6.3 miRNA生物信息学预测 | 第21页 |
| 6.4 靶基因生物信息学预测 | 第21-22页 |
| 6.5 降解组测序技术 | 第22页 |
| 7 目的与意义 | 第22-23页 |
| 第二章 材料与方法 | 第23-41页 |
| 1 材料 | 第23-27页 |
| 1.1 实验样品 | 第23-26页 |
| 1.1.1 组织样品 | 第23页 |
| 1.1.2 载体、菌株和细胞系 | 第23页 |
| 1.1.3 主要仪器设备 | 第23-24页 |
| 1.1.4 主要试剂与试剂盒 | 第24-25页 |
| 1.1.5 常用试剂及配制 | 第25-26页 |
| 1.2 应用到的生物信息学网站及分析软件 | 第26-27页 |
| 2 试验方法 | 第27-41页 |
| 2.1 试猪处理及卵泡采集 | 第27页 |
| 2.1.1 激素处理 | 第27页 |
| 2.1.2 样品采集 | 第27页 |
| 2.2 猪卵泡组织的总RNA的提取及检测 | 第27-28页 |
| 2.2.1 猪卵泡组织总RNA提取 | 第27-28页 |
| 2.2.2 总RNA检测 | 第28页 |
| 2.3 Solexa测序、数据产生和生物信息学数据分析 | 第28页 |
| 2.4 降解组测序及数据分析 | 第28-29页 |
| 2.5 差异表达miRNAs的验证 | 第29-33页 |
| 2.5.1 总RNA去基因组污染 | 第29页 |
| 2.5.2 茎环引物反转录合成第一链的cDNA | 第29页 |
| 2.5.3 cDNA检测 | 第29-30页 |
| 2.5.4 miRNA成熟序列扩增引物和反转录茎环引物 | 第30页 |
| 2.5.5 miRNAs成熟序列的扩增 | 第30-31页 |
| 2.5.6 miRNAs的克隆鉴定 | 第31-33页 |
| 2.5.7 miRNA mimic和inhibitor的合成 | 第33页 |
| 2.6 实时定量验证Solexa测序结果 | 第33页 |
| 2.7 降解组数据分析及生物信息学靶基因预测 | 第33-34页 |
| 2.8 双荧光素酶报告载体的构建 | 第34-36页 |
| 2.8.1 插入片段的扩增 | 第34页 |
| 2.8.2 载体的连接和序列测序 | 第34-35页 |
| 2.8.3 重组质粒的提取和鉴定 | 第35-36页 |
| 2.9 细胞转染 | 第36-41页 |
| 2.9.1 细胞的培养和传代 | 第36-37页 |
| 2.9.2 细胞的冻存 | 第37页 |
| 2.9.3 细胞复苏 | 第37页 |
| 2.9.4 mimic和重组载体转染中国仓鼠卵巢细胞(瞬时转染) | 第37-38页 |
| 2.9.5 双荧光素酶相对活性测定 | 第38页 |
| 2.9.6 miRNA mimic转染猪肾细胞(瞬时转染) | 第38页 |
| 2.9.7 转染后miRNA和mRNA的检测 | 第38-41页 |
| 第三章 结果与分析 | 第41-63页 |
| 1 猪卵泡组织总RNA的质量检测 | 第41-42页 |
| 1.1 总RNA浓度的测定 | 第41页 |
| 1.2 总RNA的电泳检测 | 第41-42页 |
| 2 Solexa测序及生物信息学分析结果 | 第42-48页 |
| 2.1 数据的统计分析 | 第42-44页 |
| 2.2 Small RNA的长度分布情况 | 第44页 |
| 2.3 Small RNA在基因组上的分布 | 第44-45页 |
| 2.4 小RNA与重复序列的比对结果 | 第45-46页 |
| 2.5 新miRNAs及其靶基因预测 | 第46-47页 |
| 2.6 miRNAs的变异统计 | 第47页 |
| 2.7 差异表达的miRNAs筛选 | 第47-48页 |
| 3 降解组测序及生物信息学分析 | 第48-53页 |
| 3.1 降解组序列注释 | 第48-49页 |
| 3.2 降解组测序RNA片段长度分布 | 第49-50页 |
| 3.3 降解组RNA片段在基因组上的分布 | 第50-51页 |
| 3.4 降解组测序的靶基因分析 | 第51-53页 |
| 3.5 差异表达miRNAs与降解组靶基因的网络分析 | 第53页 |
| 4 卵泡cDNA检测结果 | 第53-54页 |
| 4.1 miRNA的cDNA检测结果 | 第53-54页 |
| 4.2 miRNAs成熟序列的扩增及定量结果 | 第54页 |
| 5 双荧光素酶报告载体的构建与鉴定 | 第54-60页 |
| 5.1 插入片段的扩增 | 第54-55页 |
| 5.2 重组质粒的鉴定 | 第55-56页 |
| 5.3 荧光显微镜下观察转染效率 | 第56-57页 |
| 5.4 miRNAs与靶基因结合位点分析 | 第57-59页 |
| 5.5 双荧光素酶的活性检测 | 第59-60页 |
| 6 细胞水平miRNA超表达和抑制表达结果 | 第60-63页 |
| 6.1 荧光定量PCR检测转染后细胞中的miR-144 | 第60-61页 |
| 6.2 荧光定量PCR检测靶基因mRNA的表达水平 | 第61-63页 |
| 第四章 讨论 | 第63-69页 |
| 1 关于大白猪和二花脸猪差异表达的miRNAs | 第63-64页 |
| 2 关于降解组测序 | 第64页 |
| 3 关于线粒体靶基因 | 第64-65页 |
| 4 关于miR-144的靶基因的预测 | 第65-66页 |
| 5 关于PTGS2基因 | 第66页 |
| 6 关于CFTR基因 | 第66-67页 |
| 7 关于实时定量PCR | 第67页 |
| 8 关于双荧光载体构建和荧光检测 | 第67-68页 |
| 9 不足之处和下一步的工作计划 | 第68-69页 |
| 小结 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 附录 | 第81-95页 |
