| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-19页 |
| 1.1 苦荞简介 | 第12页 |
| 1.2 金属硫蛋白的研究概述 | 第12-17页 |
| 1.2.1 金属硫蛋白的结构特性 | 第12-14页 |
| 1.2.2 金属硫蛋白的生理功能 | 第14-15页 |
| 1.2.3 金属硫蛋白的表达调控 | 第15-17页 |
| 1.3 本研究的目的、意义及技术路线 | 第17-19页 |
| 1.3.1 研究的目的和意义 | 第17-18页 |
| 1.3.2 研究路线 | 第18-19页 |
| 第二章 苦荞Ⅱ型金属硫蛋白基因(FtMT2)的克隆及序列分析 | 第19-26页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第19-20页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第19页 |
| 2.1.2 菌株与试剂 | 第19页 |
| 2.1.3 实验仪器设备 | 第19页 |
| 2.1.4 溶液配制 | 第19-20页 |
| 2.2 方法 | 第20-23页 |
| 2.2.1 苦荞基因组提取、RNA提取及反转录 | 第20-21页 |
| 2.2.2 苦荞FtMT2基因的克隆 | 第21-23页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第23-25页 |
| 2.3.1 RNA结果分析 | 第23页 |
| 2.3.2 苦荞FtMT2的基因克隆及生物信息学分析 | 第23-25页 |
| 2.4 讨论 | 第25-26页 |
| 第三章 FtMT2的原核表达及功能验证 | 第26-42页 |
| 3.1 实验材料 | 第26-28页 |
| 3.1.1 菌种和质粒 | 第26页 |
| 3.1.2 工具酶及主要试剂 | 第26页 |
| 3.1.3 设备仪器 | 第26页 |
| 3.1.4 试剂配制 | 第26-28页 |
| 3.2 实验方法 | 第28-34页 |
| 3.2.1 重组质粒构建及重组蛋白的诱导表达 | 第28-29页 |
| 3.2.2 重组蛋白SDS-PAGE检测 | 第29-30页 |
| 3.2.3 重组蛋白可溶性分析 | 第30页 |
| 3.2.4 重组蛋白的纯化 | 第30-31页 |
| 3.2.5 蛋白含量的测定 | 第31页 |
| 3.2.6 重金属结合材料的制备 | 第31-32页 |
| 3.2.7 FtMT2对羟自由基去除能力的测定 | 第32-33页 |
| 3.2.8 大肠杆菌的功能验证 | 第33页 |
| 3.2.9 FtMT2转基因酵母的构建 | 第33-34页 |
| 3.2.10 FtMT2转基因酵母的功能验证 | 第34页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第34-41页 |
| 3.3.1 蛋白表达及纯化 | 第34-38页 |
| 3.3.2 重金属结合的重组蛋白制备 | 第38-39页 |
| 3.3.3 重组蛋白的抗氧化性 | 第39页 |
| 3.3.4 大肠杆菌功能验证 | 第39-40页 |
| 3.3.5 酵母功能验证 | 第40-41页 |
| 3.4 讨论 | 第41-42页 |
| 第四章 植物表达载体构建及转基因拟南芥筛选 | 第42-49页 |
| 4.1 材料与试剂 | 第42页 |
| 4.1.1 材料 | 第42页 |
| 4.1.2 菌株和载体 | 第42页 |
| 4.1.3 主要试剂和工具酶 | 第42页 |
| 4.1.4 仪器 | 第42页 |
| 4.2 方法 | 第42-46页 |
| 4.2.1 FtMT2过表达片段的扩增 | 第42-43页 |
| 4.2.2 pCAMBIA3301载体的双酶切 | 第43-44页 |
| 4.2.3 FtMT2过表达片段与载体重组 | 第44页 |
| 4.2.4 重组产物转化TOP10感受态 | 第44页 |
| 4.2.5 FtMT2过表达载体的鉴定 | 第44页 |
| 4.2.6 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备及转化 | 第44-45页 |
| 4.2.7 根癌农杆菌GV3101转化菌的鉴定及侵染 | 第45页 |
| 4.2.8 转基因植株筛选 | 第45页 |
| 4.2.9 苦荞叶片注射法的瞬时表达初探 | 第45-46页 |
| 4.3 结果 | 第46-48页 |
| 4.3.1 pCAMBIA3301-FtMT2过表达载体的构建 | 第46页 |
| 4.3.2 pCAMBIA3301-FtMT2农杆菌鉴定 | 第46-47页 |
| 4.3.3 FtMT2转基因拟南芥的Basta筛选 | 第47页 |
| 4.3.4 FtMT2转基因拟南芥的PCR鉴定 | 第47-48页 |
| 4.3.5 苦荞叶片中GFP蛋白的瞬时表达 | 第48页 |
| 4.4 讨论 | 第48-49页 |
| 第五章 FtMT2启动克隆及Cu2+响应 | 第49-61页 |
| 5.1 材料与试剂 | 第49-50页 |
| 5.1.1 材料 | 第49页 |
| 5.1.2 菌株和载体 | 第49页 |
| 5.1.3 工具酶和主要试剂 | 第49页 |
| 5.1.4 仪器 | 第49-50页 |
| 5.2 方法 | 第50-53页 |
| 5.2.1 苦荞FtMT2启动子克隆 | 第50-51页 |
| 5.2.2 FtMT2启动子的序列分析 | 第51页 |
| 5.2.3 苦荞FtMT2启动子双荧光素酶报告基因载体构建 | 第51-52页 |
| 5.2.4 苦荞叶肉细胞原生质的制备 | 第52页 |
| 5.2.5 原生质体的瞬时转化及Cu2+处理 | 第52-53页 |
| 5.2.6 双荧光素酶的活性测定 | 第53页 |
| 5.2.7 数据处理 | 第53页 |
| 5.2.8 FtMT2启动子区域MRE-like sequence的点突变 | 第53页 |
| 5.2.9 MRE-like sequence的点突变的gus报告基因载体构建 | 第53页 |
| 5.2.10 启动子-gus转基因拟南芥的构建 | 第53页 |
| 5.3 结果 | 第53-59页 |
| 5.3.1 FtMT2的启动子克隆 | 第53-54页 |
| 5.3.2 FtMT2的启动子序列分析 | 第54-56页 |
| 5.3.3 启动子双荧光素酶报告基因载体构建 | 第56页 |
| 5.3.4 CuSO4胁迫下FtMT2启动子活性分析 | 第56-57页 |
| 5.3.5 FtMT2启动子区域MRE-like sequence的点突变 | 第57-58页 |
| 5.3.6 MRE-like sequence的点突变的gus报告基因载体构建 | 第58-59页 |
| 5.3.7 启动子转基拟南芥的筛选 | 第59页 |
| 5.4 讨论 | 第59-61页 |
| 第六章 结论与展望 | 第61-62页 |
| 6.1 结论 | 第61页 |
| 6.2 展望 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-67页 |
| 附录 | 第67-70页 |
| 缩略词 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 作者简介 | 第72页 |
