| 中文摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 前言 | 第15-25页 |
| 参考文献 | 第20-25页 |
| 第一章 姜黄素诱导人脂肪肉瘤细胞凋亡的机理研究 | 第25-72页 |
| 绪言 | 第25-27页 |
| 参考文献 | 第25-27页 |
| 第一节 姜黄素选择性诱导人脂肪肉瘤细胞凋亡 | 第27-39页 |
| 1.1 实验材料 | 第27-28页 |
| 1.1.1 试剂 | 第27页 |
| 1.1.2 仪器 | 第27-28页 |
| 1.2 实验方法 | 第28-30页 |
| 1.2.1 人正常脂肪来源细胞的分离 | 第28页 |
| 1.2.2 脂肪细胞分化 | 第28页 |
| 1.2.3 油红O染色 | 第28-29页 |
| 1.2.4 细胞增殖实验 | 第29页 |
| 1.2.5 免疫印迹分析 | 第29-30页 |
| 1.2.6 细胞表面分子染色流式分析 | 第30页 |
| 1.2.7 Caspase 3,Caspase 8的酶活测定 | 第30页 |
| 1.2.8 统计方法 | 第30页 |
| 1.3 实验结果 | 第30-35页 |
| 1.3.1 人正常脂肪来源细胞的分离和鉴定 | 第30-31页 |
| 1.3.2 姜黄素选择性抑制人脂肪肉瘤细胞生存而不影响人正常脂肪细胞 | 第31-33页 |
| 1.3.3 姜黄素诱导脂肪肉瘤细胞Caspase 8/3通路介导的凋亡 | 第33-34页 |
| 1.3.4 姜黄素促进脂肪肉瘤细胞TRAIL-R2的表达 | 第34-35页 |
| 1.4 讨论 | 第35-37页 |
| 1.5 小结 | 第37页 |
| 1.6 参考文献 | 第37-39页 |
| 第二节 姜黄素诱发人脂肪肉瘤细胞中的内质网应激反应 | 第39-53页 |
| 2.1 实验材料 | 第39-40页 |
| 2.1.1 试剂 | 第39页 |
| 2.1.2 仪器 | 第39-40页 |
| 2.2 实验方法 | 第40-44页 |
| 2.2.1 RNA提取 | 第40页 |
| 2.2.2 RNA反转 | 第40页 |
| 2.2.3 实时定量荧光 | 第40-41页 |
| 2.2.4 聚合酶链式反应 | 第41页 |
| 2.2.5 电泳及切胶回收 | 第41-42页 |
| 2.2.6 质粒提取 | 第42页 |
| 2.2.7 核酸限制性酶切及连接 | 第42页 |
| 2.2.8 感受态细胞的制备 | 第42-43页 |
| 2.2.9 质粒的转化 | 第43页 |
| 2.2.10 筛选阳性克隆 | 第43-44页 |
| 2.2.11 真核细胞转染 | 第44页 |
| 2.2.12 G418筛选及稳定转染 | 第44页 |
| 2.2.13 细胞增殖实验 | 第44页 |
| 2.2.14 免疫印迹分析 | 第44页 |
| 2.2.15 细胞表面分子染色流式分析 | 第44页 |
| 2.2.16 统计方法 | 第44页 |
| 2.3 实验结果 | 第44-49页 |
| 2.3.1 姜黄素通过引发脂肪肉瘤细胞的内质网应激从而诱导凋亡 | 第45-46页 |
| 2.3.2 姜黄素不通过UPR引起脂肪肉瘤细胞的内质网应激 | 第46-48页 |
| 2.3.3 Thapsigargin诱导类似姜黄素的人脂肪肉瘤细胞的凋亡 | 第48-49页 |
| 2.4 讨论 | 第49-51页 |
| 2.5 小结 | 第51页 |
| 2.6 参考文献 | 第51-53页 |
| 第三节 姜黄素结合并抑制脂肪肉瘤细胞肌浆网钙蛋白2的活性 | 第53-64页 |
| 3.1 实验材料 | 第53页 |
| 3.1.1 试剂 | 第53页 |
| 3.1.2 仪器 | 第53页 |
| 3.2 实验方法 | 第53-54页 |
| 3.2.1 聚合酶链式反应 | 第53页 |
| 3.2.2 电泳及切胶回收 | 第53页 |
| 3.2.3 核酸限制性酶切及连接 | 第53-54页 |
| 3.2.4 感受态细胞的制备 | 第54页 |
| 3.2.5 质粒的转化 | 第54页 |
| 3.2.6 筛选阳性克隆 | 第54页 |
| 3.2.7 质粒提取 | 第54页 |
| 3.2.8 真核细胞转染 | 第54页 |
| 3.2.9 G418筛选及稳定转染 | 第54页 |
| 3.2.10 免疫印迹分析 | 第54页 |
| 3.2.11 细胞增殖实验 | 第54页 |
| 3.2.12 统计方法 | 第54页 |
| 3.3 实验结果 | 第54-60页 |
| 3.3.1 姜黄素抑制脂肪肉瘤细胞内Ca~(2+)-ATPase活性 | 第54-55页 |
| 3.3.2 SERCA家族各isoforms在正常脂肪和脂肪肉瘤细胞内的表达 | 第55-56页 |
| 3.3.3 姜黄素和SERCA2b蛋白分子对接 | 第56-57页 |
| 3.3.4 姜黄素特异性定位于脂肪肉瘤细胞内质网 | 第57-58页 |
| 3.3.5 SERCA2b小干扰RNA部分逆转姜黄素引发的凋亡 | 第58-59页 |
| 3.3.6 在SW872细胞中稳定转染SERCA2b可以部分逆转姜黄素的作用 | 第59-60页 |
| 3.4 讨论 | 第60-61页 |
| 3.5 小结 | 第61-62页 |
| 3.6 参考文献 | 第62-64页 |
| 第四节 姜黄素的体内抗脂肪肉瘤活性 | 第64-72页 |
| 4.1 实验材料 | 第64页 |
| 4.1.1 试剂 | 第64页 |
| 4.1.2 仪器 | 第64页 |
| 4.1.3 实验动物 | 第64页 |
| 4.2 实验方法 | 第64-65页 |
| 4.2.1 SCID小鼠腋窝皮下原位肿瘤接种 | 第64页 |
| 4.2.2 免疫组织化学 | 第64-65页 |
| 4.2.3 Tunnel染色 | 第65页 |
| 4.2.4 免疫印迹分析 | 第65页 |
| 4.3 实验结果 | 第65-69页 |
| 4.3.1 SERCA2b与人脂肪肉瘤恶性程度相关性 | 第65-67页 |
| 4.3.2 姜黄素抑制脂肪肉瘤细胞在SCID小鼠体内的生长 | 第67-69页 |
| 4.4 讨论 | 第69-70页 |
| 4.5 小结 | 第70页 |
| 4.6 参考文献 | 第70-72页 |
| 第二章 SERCA2b抵抗脂肪肉瘤细胞分化的作用 | 第72-98页 |
| 绪言 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第72-74页 |
| 2.1 实验材料 | 第74页 |
| 2.1.1 试剂 | 第74页 |
| 2.1.2 仪器 | 第74页 |
| 2.2 实验方法 | 第74-77页 |
| 2.2.1 人原代脂肪肉瘤细胞的分离、培养 | 第74-75页 |
| 2.2.2 脂肪细胞的分化 | 第75页 |
| 2.2.3 实时定量荧光PCR | 第75页 |
| 2.2.4 免疫印迹分析 | 第75页 |
| 2.2.5 ROS流式检测 | 第75页 |
| 2.2.6 细胞基因组DNA提取 | 第75-76页 |
| 2.2.7 免疫荧光 | 第76页 |
| 2.2.8 聚合酶链式反应 | 第76-77页 |
| 2.2.9 统计方法 | 第77页 |
| 2.3 实验结果 | 第77-91页 |
| 2.3.1 脂肪肉瘤细胞在体内的分化现象 | 第77-80页 |
| 2.3.2 过表达SERCA2b抵抗脂肪肉瘤细胞的分化 | 第80-81页 |
| 2.3.3 SERCA2b上调ERK磷酸化水平从而抑制PPAR-γ的功能 | 第81-83页 |
| 2.3.4 SERCA2b非酶活依赖性地上调磷酸化ERK水平 | 第83-84页 |
| 2.3.5 SERCA2b激活MEK/ERK通路与PKC通路无关 | 第84-86页 |
| 2.3.6 SERCA2b上调突变型b-raf的磷酸化水平 | 第86-87页 |
| 2.3.7 SERCA2b激活MEK/ERK通路与上调ROS水平相关 | 第87-88页 |
| 2.3.8 SERCA2b蛋白的nucleotide binding domain上调ERK磷酸化水平 | 第88-90页 |
| 2.3.9 ROS抑制剂可以逆转SWS细胞体外的分化抵抗 | 第90-91页 |
| 2.4 讨论 | 第91-94页 |
| 2.5 小结 | 第94-95页 |
| 2.6 参考文献 | 第95-98页 |
| 第三章 人脂肪肉瘤干细胞样细胞的分离和鉴定 | 第98-149页 |
| 绪言 | 第98-101页 |
| 参考文献 | 第99-101页 |
| 第一节 脂肪肉瘤高恶性程度亚系SW872-S的分离、培养和鉴定 | 第101-108页 |
| 1.1 实验材料 | 第101页 |
| 1.1.1 试剂 | 第101页 |
| 1.1.2 仪器 | 第101页 |
| 1.1.3 动物 | 第101页 |
| 1.2 实验方法 | 第101-102页 |
| 1.2.1 原代肿瘤细胞分离 | 第101-102页 |
| 1.2.2 克隆形成 | 第102页 |
| 1.2.3 H&E染色 | 第102页 |
| 1.2.4 统计方法 | 第102页 |
| 1.3 实验结果 | 第102-105页 |
| 1.3.1 脂肪肉瘤高恶性亚细胞系SW872-S的建立 | 第102-103页 |
| 1.3.2 SW872-S和SW872细胞系体内增殖能力的比较 | 第103-104页 |
| 1.3.3 SW872-S和SW872细胞系体外、体内克隆能力的比较 | 第104-105页 |
| 1.4 讨论 | 第105-106页 |
| 1.5 小结 | 第106-107页 |
| 1.6 参考文献 | 第107-108页 |
| 第二节 SW872-S细胞与亲代SW872细胞表面marker的鉴定 | 第108-116页 |
| 2.1 实验材料 | 第108页 |
| 2.1.1 试剂 | 第108页 |
| 2.1.2 仪器 | 第108页 |
| 2.2 实验方法 | 第108-110页 |
| 2.2.1 聚合酶链式反应 | 第108-109页 |
| 2.2.2 荧光定量PCR | 第109页 |
| 2.2.3 细胞粘附实验 | 第109-110页 |
| 2.2.4 细胞表面分子染色流式分析 | 第110页 |
| 2.2.5 统计方法 | 第110页 |
| 2.3 实验结果 | 第110-113页 |
| 2.3.1 各种细胞表面marker表达的比较 | 第110-111页 |
| 2.3.2 SW872-S和SW872细胞系粘附能力的比较 | 第111页 |
| 2.3.3 整合素α6在SW872和SW872-S细胞中的表达差异 | 第111-113页 |
| 2.4 讨论 | 第113-114页 |
| 2.5 小结 | 第114页 |
| 2.6 参考文献 | 第114-116页 |
| 第三节 整合素α6在SW872-S细胞中的功能 | 第116-125页 |
| 3.1 实验材料 | 第116页 |
| 3.1.1 试剂 | 第116页 |
| 3.1.2 仪器 | 第116页 |
| 3.2 实验方法 | 第116-117页 |
| 3.2.1 细胞增殖实验 | 第116页 |
| 3.2.2 流式分选 | 第116页 |
| 3.2.3 真核细胞转染 | 第116页 |
| 3.2.4 细胞表面分子染色流式分析 | 第116页 |
| 3.2.5 免疫组化 | 第116-117页 |
| 3.2.6 原代脂肪肉瘤细胞分离及培养 | 第117页 |
| 3.2.7 统计方法 | 第117页 |
| 3.3 实验结果 | 第117-122页 |
| 3.3.1 整合素α6对细胞增殖能力的影响 | 第117-118页 |
| 3.3.2 整合素α6小干扰RNA和特异性单克隆抗体的治疗效果 | 第118-119页 |
| 3.3.3 脂肪肉瘤病人复发病灶中α6表达水平鉴定 | 第119-122页 |
| 3.4 讨论 | 第122-123页 |
| 3.5 小结 | 第123页 |
| 3.6 参考文献 | 第123-125页 |
| 第四节 整合素α6作为脂肪肉瘤干细胞marker | 第125-135页 |
| 4.1 实验材料 | 第125页 |
| 4.1.1 试剂 | 第125页 |
| 4.1.2 仪器 | 第125页 |
| 4.2 实验方法 | 第125-126页 |
| 4.2.1 细胞表面分子染色流式分析 | 第125页 |
| 4.2.2 免疫荧光 | 第125-126页 |
| 4.2.3 肿瘤细胞原位接种 | 第126页 |
| 4.2.4 流式分选 | 第126页 |
| 4.2.5 免疫印迹分析 | 第126页 |
| 4.2.6 克隆形成 | 第126页 |
| 4.2.7 统计方法 | 第126页 |
| 4.3 实验结果 | 第126-131页 |
| 4.3.1 无血清培养体系中整合素α6阳性细胞亚群的增殖能力 | 第126-127页 |
| 4.3.2 整合素α6在细胞有丝分裂中的不对称分布现象 | 第127-128页 |
| 4.3.3 整合素α6高表达细胞亚群有分化成低表达细胞亚群的能力 | 第128-129页 |
| 4.3.4 整合素α6高表达和低表达细胞亚群在体外克隆和体内生长方面的差异 | 第129-130页 |
| 4.3.5 整合素α6高表达细胞亚群中FAK/Src/Akt通路的激活 | 第130-131页 |
| 4.4 讨论 | 第131-133页 |
| 4.5 小结 | 第133页 |
| 4.6 参考文献 | 第133-135页 |
| 第五节 整合素α6的共同高表达表面分子CD13的发现与功能 | 第135-149页 |
| 5.1 实验材料 | 第135-136页 |
| 5.1.1 试剂 | 第135页 |
| 5.1.2 仪器 | 第135页 |
| 5.1.3 细胞 | 第135-136页 |
| 5.2 实验方法 | 第136-137页 |
| 5.2.1 实时定量荧光PCR | 第136页 |
| 5.2.2 细胞表面分子染色流式分析 | 第136页 |
| 5.2.3 细胞增殖实验 | 第136页 |
| 5.2.4 流式分选 | 第136页 |
| 5.2.5 真核细胞转染 | 第136页 |
| 5.2.6 统计方法 | 第136-137页 |
| 5.3 实验结果 | 第137-145页 |
| 5.3.1 SW872细胞和SW872-S细胞在脂肪干细胞marker表达的差异 | 第137页 |
| 5.3.2 脂肪肉瘤整合素α6高、低表达细胞亚群在脂肪干细胞marker表达的差异 | 第137-138页 |
| 5.3.3 整合素α6,CD13在多种人肿瘤细胞系中共同高表达 | 第138-141页 |
| 5.3.4 整合素α6,CD13双阳性细胞亚群高表达Bcl2和磷酸化Src | 第141页 |
| 5.3.5 CD13特异性小分子抑制剂选择性抑制整合素α6高表达亚群的生存率 | 第141-143页 |
| 5.3.6 整合素α6和CD13互不影响表达 | 第143-144页 |
| 5.3.7 整合素α6高表达细胞内激活的SERCA2b/ROS/ERK通路 | 第144-145页 |
| 5.4 讨论 | 第145-147页 |
| 5.5 小结 | 第147页 |
| 5.6 参考文献 | 第147-149页 |
| 结语 | 第149-150页 |
| 附录一 | 第150-152页 |
| 附录二 | 第152-153页 |
| 致谢 | 第153-154页 |
