| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-43页 |
| ·立体选择性氧化还原酶的研究概况 | 第16-17页 |
| ·立体选择性氧化还原酶催化体系 | 第17-22页 |
| ·氧化还原酶体系的认识 | 第17页 |
| ·氧化还原酶的基因克隆及表达 | 第17-18页 |
| ·氧化还原酶基因的优化表达 | 第18-20页 |
| ·氧化还原酶的纯化、酶学性质及亚细胞定位 | 第20-21页 |
| ·氧化还原酶的辅酶选择性及辅酶再生 | 第21-22页 |
| ·脱氢酶（还原酶）的结构与功能 | 第22-34页 |
| ·脱氢酶的分类 | 第22-24页 |
| ·短链脱氢酶序列分析比较 | 第24页 |
| ·短链脱氢酶的亚类 | 第24-26页 |
| ·短链脱氢酶的单体结构 | 第26-29页 |
| ·短链脱氢酶的催化功能和理性改造 | 第29-34页 |
| ·蛋白质晶体学的研究进展 | 第34-38页 |
| ·蛋白质结构解析的主要步骤 | 第34-35页 |
| ·蛋白质结晶 | 第35-36页 |
| ·相位的确定 | 第36-37页 |
| ·结构修正 | 第37-38页 |
| ·模型质量分析结构修正 | 第38页 |
| ·本课题研究内容 | 第38-43页 |
| ·本研究所用立体选择性氧化还原酶的背景 | 第38-39页 |
| ·本课题研究目的和意义 | 第39-40页 |
| ·本课题研究思路与内容 | 第40-42页 |
| ·论文各部分的主要内容 | 第42-43页 |
| 第二章 (R)-羰基还原酶的密码子优化表达和理化性质研究 | 第43-61页 |
| ·前言 | 第43-44页 |
| ·材料与方法 | 第44-52页 |
| ·菌种和质粒 | 第44页 |
| ·培养基 | 第44页 |
| ·主要试剂 | 第44-45页 |
| ·主要仪器 | 第45-46页 |
| ·(R)-羰基还原酶密码子优化基因的克隆 | 第46-49页 |
| ·(R)-羰基还原酶的诱导表达 | 第49页 |
| ·酶的纯化 | 第49-50页 |
| ·目的蛋白的质谱分析 | 第50页 |
| ·酶活力测定 | 第50-51页 |
| ·重组菌细胞催化不对称转化 | 第51页 |
| ·原子力显微镜(AFM)观察蛋白形态 | 第51页 |
| ·超速离心分析 | 第51-52页 |
| ·圆二色谱(CD)分析 | 第52页 |
| ·荧光色谱分析 | 第52页 |
| ·结果 | 第52-59页 |
| ·密码子优化基因的克隆 | 第52-53页 |
| ·密码子优化提高蛋白表达水平 | 第53-54页 |
| ·重组(R)-羰基还原酶的纯化 | 第54-55页 |
| ·酶蛋白质谱和聚合态分析 | 第55-56页 |
| ·密码子优化提高酶的生物转化能力 | 第56页 |
| ·原子力显微镜观察分析酶蛋白分子形态 | 第56-57页 |
| ·辅酶诱导酶蛋白构象的变化 | 第57-58页 |
| ·酶对NAD+和NADH 具有不同亲和性 | 第58-59页 |
| ·讨论 | 第59-60页 |
| ·小结 | 第60-61页 |
| 第三章 (R)-和(S)-羰基还原酶在酿酒酵母中的功能表达和亚细胞定位 | 第61-71页 |
| ·前言 | 第61页 |
| ·材料与方法 | 第61-66页 |
| ·菌种 | 第61页 |
| ·培养基 | 第61页 |
| ·主要试剂 | 第61-62页 |
| ·主要仪器 | 第62-63页 |
| ·重组酿酒酵母的构建 | 第63-65页 |
| ·重组蛋白的SDS-PAGE 分析 | 第65页 |
| ·酿酒酵母重组蛋白的纯化 | 第65页 |
| ·激光共聚焦显微镜观察 | 第65页 |
| ·酶活力及蛋白含量的测定 | 第65页 |
| ·重组菌细胞催化不对称转化 | 第65-66页 |
| ·结果 | 第66-69页 |
| ·重组质粒的构建 | 第66页 |
| ·融合基因与pYX212 载体的连接 | 第66-67页 |
| ·两种羰基还原酶在酿酒酵母中的表达 | 第67页 |
| ·两种酿酒酵母重组型羰基还原酶的纯化 | 第67-68页 |
| ·重组细胞高效催化不对称转化反应 | 第68-69页 |
| ·两种羰基还原酶的亚细胞定位 | 第69页 |
| ·讨论 | 第69-70页 |
| ·小结 | 第70-71页 |
| 第四章 (R)-和(S)-羰基还原酶在毕赤氏酵母中的高效表达及一步法纯化策略 | 第71-86页 |
| ·前言 | 第71页 |
| ·材料与方法 | 第71-76页 |
| ·菌种与质粒 | 第71-72页 |
| ·培养基 | 第72页 |
| ·主要试剂 | 第72页 |
| ·主要仪器 | 第72-73页 |
| ·重组毕赤氏酵母的构建 | 第73-74页 |
| ·重组毕赤氏酵母的优化表达 | 第74-75页 |
| ·重组蛋白的SDS-PAGE 分析 | 第75页 |
| ·毕赤氏酵母重组蛋白的纯化 | 第75页 |
| ·酶活力及蛋白含量的测定 | 第75页 |
| ·Western 杂交 | 第75-76页 |
| ·结果 | 第76-84页 |
| ·重组质粒 pPIC9K-his6-rcr 的构建 | 第76-77页 |
| ·毕赤氏酵母阳性克隆的选择 | 第77页 |
| ·6×Histidine 融合蛋白在毕赤氏酵母中的优化表达 | 第77-80页 |
| ·从培养液中高效分离纯化出重组目标蛋白 | 第80-81页 |
| ·以2-羟基苯乙酮为底物的酶活性的确定 | 第81-82页 |
| ·不同的pH 值对酶催化2-羟基苯乙酮还原反应的影响 | 第82-83页 |
| ·少量的ZnCl_2 较好地促进(R)-羰基还原酶的转化效率 | 第83-84页 |
| ·讨论 | 第84-85页 |
| ·小结 | 第85-86页 |
| 第五章 (R)、(S)-羰基还原酶和嘧啶核苷酸转氢酶偶联一步法催化(S)-苯基乙二醇 | 第86-98页 |
| ·前言 | 第86-87页 |
| ·材料与方法 | 第87-90页 |
| ·菌种与质粒 | 第87页 |
| ·培养基 | 第87页 |
| ·主要试剂 | 第87页 |
| ·主要仪器 | 第87-88页 |
| ·菌体培养及其基因组DNA 的提取 | 第88页 |
| ·(R)-和(S)-羰基还原酶基因的克隆 | 第88-89页 |
| ·嘧啶核苷酸转氢酶A 亚基（PNTA）和B 亚基（PNTB）基因序列的扩增 | 第89-90页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌 | 第90页 |
| ·重组菌细胞催化不对称转化 | 第90页 |
| ·结果 | 第90-95页 |
| ·四个目的基因的克隆 | 第90-91页 |
| ·表达质粒的构建 | 第91-94页 |
| ·四种目标酶的表达 | 第94-95页 |
| ·重组细胞催化不对称转化 | 第95页 |
| ·讨论 | 第95-96页 |
| ·小结 | 第96-98页 |
| 第六章 (S)-羰基还原酶的晶体生长与结构解析 | 第98-116页 |
| ·前言 | 第98页 |
| ·材料与方法 | 第98-103页 |
| ·菌种 | 第98页 |
| ·培养基 | 第98-99页 |
| ·主要试剂 | 第99页 |
| ·主要仪器 | 第99-100页 |
| ·(S)-羰基还原酶基因的克隆 | 第100-101页 |
| ·(S)-羰基还原酶的诱导表达分析 | 第101页 |
| ·酶的纯化 | 第101-102页 |
| ·酶活力测定 | 第102页 |
| ·重组菌细胞催化不对称转化 | 第102页 |
| ·蛋白样品的预处理 | 第102-103页 |
| ·蛋白结晶条件的筛选和优化 | 第103页 |
| ·衍射数据的收集和处理 | 第103页 |
| ·晶体结构的解析和修正 | 第103页 |
| ·结果 | 第103-114页 |
| ·(S)-羰基还原酶蛋白的表达与纯化 | 第103-105页 |
| ·重组(S)-羰基还原酶的结晶筛选与优化 | 第105-106页 |
| ·衍射数据的收集与处理 | 第106页 |
| ·分子置换法解析(S)-羰基还原酶的母体晶体结构 | 第106-107页 |
| ·(S)-羰基还原酶的母体晶体结构分析 | 第107-114页 |
| ·讨论 | 第114页 |
| ·小结 | 第114-116页 |
| 第七章 (S)-羰基还原酶结构中关键氨基酸位点的功能研究 | 第116-129页 |
| ·前言 | 第116页 |
| ·材料与方法 | 第116-121页 |
| ·菌种 | 第116页 |
| ·培养基 | 第116页 |
| ·主要试剂 | 第116页 |
| ·主要仪器 | 第116-118页 |
| ·(S)-羰基还原酶突变体基因的克隆 | 第118-119页 |
| ·(S)-羰基还原酶突变体蛋白的诱导表达分析 | 第119页 |
| ·酶的纯化 | 第119-120页 |
| ·酶活力测定 | 第120页 |
| ·重组菌细胞催化不对称转化 | 第120页 |
| ·酶动力学研究 | 第120页 |
| ·圆二色谱 | 第120页 |
| ·超速分析 | 第120页 |
| ·荧光退火分析 | 第120-121页 |
| ·结果 | 第121-127页 |
| ·(S)-羰基还原酶突变体蛋白表达与纯化 | 第121页 |
| ·(S)-羰基还原酶突变体功能验证 | 第121-123页 |
| ·保守的Ser-Tyr-Lys 催化三元区域对催化是必需的 | 第123页 |
| ·N 末端的肽段起着平衡(S)-羰基还原酶低聚体的作用 | 第123-126页 |
| ·四聚体对(S)-羰基还原酶酶活不是必需的 | 第126-127页 |
| ·讨论 | 第127页 |
| ·小结 | 第127-129页 |
| 第八章 定点突变改变(S)-羰基还原酶的辅酶特异性和酮还原的立体选择性研究 | 第129-145页 |
| ·前言 | 第129-130页 |
| ·材料与方法 | 第130-134页 |
| ·菌种与质粒 | 第130-131页 |
| ·培养基 | 第131页 |
| ·主要试剂 | 第131页 |
| ·主要仪器 | 第131页 |
| ·(S)-羰基还原酶突变体基因的克隆 | 第131-132页 |
| ·突变基因与表达载体pET21c 的连接 | 第132-133页 |
| ·(S)-羰基还原酶的诱导表达分析 | 第133页 |
| ·酶的纯化 | 第133页 |
| ·酶活力测定与动力学分析 | 第133页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第133页 |
| ·酶催化不对称转化反应 | 第133页 |
| ·超速离心分析 | 第133页 |
| ·圆二色谱分析 | 第133页 |
| ·温度和尿素变性分析 | 第133-134页 |
| ·荧光色谱分析 | 第134页 |
| ·结果 | 第134-143页 |
| ·野生型和突变体蛋白的过量表达和纯化 | 第134-135页 |
| ·定点突变改变酶催化酮还原产物的空间选择性 | 第135-137页 |
| ·动力学特性表明 S67D/H68D 酶改变了辅酶的依赖性 | 第137-138页 |
| ·双位点突变 S67D/H68D 不改变酶蛋白的折叠合及构象稳定性 | 第138-142页 |
| ·不同的辅酶对野生型酶和突变体 S67D/H68D 具有不同的保护作用 | 第142-143页 |
| ·讨论 | 第143-144页 |
| ·小结 | 第144-145页 |
| 主要结论 | 第145-148页 |
| 论文创新点 | 第148-149页 |
| 致谢 | 第149-150页 |
| 参考文献 | 第150-164页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表(含待发表)论文及成果 | 第164-165页 |
