| 摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-21页 |
| ·酵母表达系统概况 | 第14-15页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优越性 | 第15-16页 |
| ·毕赤酵母表达系统存在的问题 | 第16-17页 |
| ·PMR1及其编码蛋白概况 | 第17-19页 |
| ·病理学研究 | 第19页 |
| ·展望 | 第19-20页 |
| ·研究目标 | 第20-21页 |
| 第二章 实验材料 | 第21-26页 |
| ·材料 | 第21-22页 |
| ·菌株 | 第21页 |
| ·质粒 | 第21页 |
| ·蛋白标准品 | 第21页 |
| ·限制性内切酶及工具酶 | 第21页 |
| ·试剂盒 | 第21页 |
| ·核酸及蛋白分子量标准 | 第21页 |
| ·主要仪器 | 第21-22页 |
| ·试剂 | 第22-26页 |
| ·主要试剂 | 第22页 |
| ·主要培养基 | 第22-23页 |
| ·主要溶液 | 第23-25页 |
| ·特异性核苷酸引物设计 | 第25-26页 |
| 第三章 实验方法 | 第26-43页 |
| ·Pichia pastoris PMR1全序列的确定 | 第26-31页 |
| ·CODEHOP PCR扩增PMR1编码序列部分片段 | 第26-29页 |
| ·反向PCR确定PMR1启动子及终止子序列 | 第29-31页 |
| ·PpPMR1全序列的克隆 | 第31页 |
| ·毕赤酵母PMR1无义突变株的构建 | 第31-39页 |
| ·打靶重组质粒pPMR1△的构建 | 第32-37页 |
| ·打靶载体pPMR1△转化巴斯德毕赤酵母菌GS115 | 第37-39页 |
| ·毕赤酵母PMR1无义突变菌株的表达评价 | 第39-43页 |
| ·PMR1缺失前后对外源蛋白表达量的影响 | 第39-41页 |
| ·PMR1缺失前后对外源蛋白糖基化水平的影响 | 第41-42页 |
| ·发酵液体积对外源蛋白表达量的影响 | 第42页 |
| ·发酵液中钙离子浓度对外源蛋白表达量的影响 | 第42-43页 |
| 第四章 实验结果 | 第43-58页 |
| ·Pichia pastoris PMR1全序列的确定 | 第43-47页 |
| ·CODEHOP PCR扩增PpPMR1编码序列部分片段 | 第43-44页 |
| ·反向PCR确定PMR1启动子及终止子序列 | 第44页 |
| ·PpPMR1全序列的确定 | 第44-47页 |
| ·毕赤酵母PMR1无义突变株的构建 | 第47-54页 |
| ·打靶重组质粒的构建 | 第47-50页 |
| ·毕赤酵母PMR1无义突变株的构建 | 第50-51页 |
| ·毕赤酵母GS115 PMR1无义突变菌株的表型特征 | 第51-52页 |
| ·毕赤酵母GS115菌PMR1缺失前后生长曲线的比较 | 第52-54页 |
| ·PMR1无义突变菌株的表达评价 | 第54-58页 |
| ·PMR1缺失前后对外源蛋白表达量的影响 | 第54-55页 |
| ·PMR1缺失前后对外源蛋白糖基化水平的影响 | 第55-56页 |
| ·发酵液中钙离子浓度对外源蛋白表达量的影响 | 第56-57页 |
| ·发酵液体积对外源蛋白表达量的影响 | 第57-58页 |
| 第五章 讨论 | 第58-63页 |
| ·CODEHOP PCR克隆未知基因反向PCR克隆新基因 | 第58-59页 |
| ·反向PCR克隆已知基因侧翼DNA序列 | 第59页 |
| ·PMR1序列的分析 | 第59-60页 |
| ·PMR1同源重组失活方法的探讨 | 第60页 |
| ·毕赤酵母重组质粒同源臂长度对重组效率的影响 | 第60-61页 |
| ·巴斯德毕赤酵母菌的转化方法 | 第61页 |
| ·PMR1敲除前后外源蛋白表达情况 | 第61-63页 |
| 结论 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 作者简介 | 第70页 |
| 学位论文期间发表文章 | 第70页 |
