| 中文摘要 | 第1-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-22页 |
| 1 引言 | 第15页 |
| 2 植酸酶的研究进展 | 第15-17页 |
| ·植酸酶的分类 | 第16页 |
| ·植酸酶的作用机理 | 第16-17页 |
| ·植酸酶的应用 | 第17页 |
| 3 植酸酶APPA | 第17-19页 |
| 4 论文的设计思路 | 第19-22页 |
| ·研究背景 | 第19-20页 |
| ·现有的部分植酸酶的热稳定性情况 | 第19页 |
| ·植酸酶热稳定性的研究 | 第19-20页 |
| ·巴斯德毕赤酵母 | 第20页 |
| ·实验目的 | 第20页 |
| ·技术方案及流程 | 第20-21页 |
| ·研究的意义 | 第21-22页 |
| 第二章 植酸酶APPA及其突变体构建和筛选 | 第22-37页 |
| 1 实验材料 | 第22-24页 |
| ·菌株和质粒 | 第22页 |
| ·主要试剂的配制 | 第22-23页 |
| ·核酸电泳及相关试剂 | 第22页 |
| ·培养基及相关试剂 | 第22-23页 |
| ·大提质粒相关试剂 | 第23页 |
| ·SDS-PAGE/Tris-Glycine相关试剂 | 第23页 |
| ·LiCl转化相关试剂 | 第23页 |
| ·钼黄法测定植酸酶活性相关试剂 | 第23页 |
| ·主要的酶和生化制剂 | 第23-24页 |
| ·主要实验仪器 | 第24页 |
| 2 实验方法 | 第24-33页 |
| ·寡核苷酸引物的设计 | 第24-25页 |
| ·植酸酶APPA的定点突变 | 第25-27页 |
| ·目的基因的定点突变PCR扩增 | 第25-26页 |
| ·叠加突变 | 第26页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第26-27页 |
| ·重组质粒pPIC9-appA~m-M1,pPIC9-appA~m-C2,pPIC9-appA~m-K24E,pPIC9-appA~m-K43E,pPIC9-appA~m-M2,pPIC9-appA~m-M4的构建 | 第27-30页 |
| ·毕赤酵母中重组质粒的转化、表达及筛选 | 第30-33页 |
| ·重组质粒的转化 | 第30-31页 |
| ·六种突变体的表达与筛选 | 第31-33页 |
| 3 实验结果 | 第33-35页 |
| ·重组质粒pGEM-T-easy-appA~m(W46E)、pGEM-T-easy-appA~m(Q62W)、pGEM-T-easy-appA~m(K24E)、pGEM-T-easy-appA~m(K43E)及pGEM-T-easy-appA~m(W46E,Q62w)、pGEM-T-easy-appA~m(W46E,Q62w,A73P,K75C)的构建 | 第33-34页 |
| ·突变重组质粒测序 | 第34-35页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第35页 |
| 4 讨论 | 第35-37页 |
| 第三章 APPA及突变体的纯化方法的探索 | 第37-46页 |
| 1 实验材料 | 第37-38页 |
| ·蛋白纯化试剂 | 第37页 |
| ·蛋白定量试剂 | 第37页 |
| ·钼蓝法酶活性测定试剂 | 第37页 |
| ·主要仪器及设备 | 第37-38页 |
| 2 实验方法 | 第38-41页 |
| ·APPA及其突变体蛋白的纯化 | 第38-39页 |
| ·粗酶液的准备 | 第38页 |
| ·硫酸铵沉淀 | 第38-39页 |
| ·离子交换层析 | 第39页 |
| ·葡聚糖凝胶层析 | 第39页 |
| ·蛋白纯化各步的蛋白定量分析 | 第39-40页 |
| ·BSA标准曲线的绘制 | 第39-40页 |
| ·各步纯化的蛋白浓度的测定 | 第40页 |
| ·纯化后蛋白的SDS-PAGE | 第40页 |
| ·纯化后蛋白的酶活力测定 | 第40-41页 |
| ·钼蓝法测定植酸酶的方法 | 第40-41页 |
| ·钼蓝法测定植酸酶酶活力的标准曲线的制作 | 第41页 |
| ·钼蓝法对植酸酶酶活力的测定 | 第41页 |
| ·蛋白纯化倍数及回收率 | 第41页 |
| 3 实验结果 | 第41-45页 |
| ·植酸酶蛋白经硫酸铵沉淀后的SDS-PAGE图 | 第41-42页 |
| ·离子交换吸附色谱 | 第42-43页 |
| ·葡聚糖凝胶层析色谱 | 第43-44页 |
| ·纯化结果 | 第44页 |
| ·APPA及各其个突变体的纯化结果 | 第44-45页 |
| 4 讨论 | 第45-46页 |
| 第四章 APPA及其突变体性质的研究 | 第46-54页 |
| 1 实验材料 | 第46-47页 |
| ·主要生化制剂 | 第46页 |
| ·主要试剂的配制 | 第46页 |
| ·钼蓝法检测植酸酶活性试剂的配制 | 第46页 |
| ·不同pH值的缓冲液的配制 | 第46页 |
| ·不同浓度植酸钠的配制 | 第46页 |
| ·主要实验仪器 | 第46-47页 |
| 2 实验方法 | 第47-49页 |
| ·钼蓝法测定植酸酶酶活力的方法 | 第47页 |
| ·最适反应pH的测定 | 第47页 |
| ·最适反应温度的测定 | 第47页 |
| ·pH稳定性的测定 | 第47-48页 |
| ·热稳定性的测定 | 第48页 |
| ·Km和Vmax的测定 | 第48-49页 |
| ·突变体植酸酶的结构模拟分析 | 第49页 |
| 3 实验结果 | 第49-53页 |
| ·APPA及其突变体植酸酶蛋白的最适反应pH | 第49-50页 |
| ·APPA及其突变体植酸酶蛋白的最适反应温度 | 第50页 |
| ·APPA及其突变体植酸酶蛋白的pH稳定性 | 第50-51页 |
| ·APPA及其突变体植酸酶蛋白的热稳定性 | 第51页 |
| ·Km和Vmax | 第51-52页 |
| ·突变体植酸酶的结构模拟分析 | 第52-53页 |
| 4. 讨论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-60页 |
| 总结与展望 | 第60-62页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第62-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 个人简况及联系方式 | 第64-66页 |
