| 目录 | 第1-8页 |
| 图表目录 | 第8-10页 |
| 中文摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 英文略语表 | 第14-17页 |
| 前言 | 第17-23页 |
| 第一部分 SARS-CoV结构蛋白基因的质粒构建及表达纯化 | 第23-55页 |
| 1 实验材料 | 第23-29页 |
| ·质粒 | 第23页 |
| ·菌株 | 第23页 |
| ·工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker | 第23页 |
| ·主要化学试剂 | 第23-24页 |
| ·细胞培养用耗材 | 第24页 |
| ·试剂盒 | 第24页 |
| ·主要仪器及设备 | 第24-25页 |
| ·主要溶液配方 | 第25-28页 |
| ·E.coli用培养基的配制 | 第25页 |
| ·制备感受态细胞相关溶液 | 第25页 |
| ·抗生素的配制 | 第25页 |
| ·大量提取质粒DNA的相关溶液 | 第25-26页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及凝胶的配制 | 第26页 |
| ·细胞冻存液的配制 | 第26页 |
| ·细胞裂解液的配制 | 第26页 |
| ·蛋白质电泳及检测缓冲液 | 第26-27页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制 | 第27页 |
| ·常用缓冲液的配制 | 第27-28页 |
| ·PCR引物 | 第28-29页 |
| 2 实验方法 | 第29-40页 |
| ·单链复性 | 第29页 |
| ·PCR扩增 | 第29-30页 |
| ·酶切消化 | 第30-31页 |
| ·连接 | 第31页 |
| ·转化 | 第31页 |
| ·鉴定 | 第31-32页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第32-33页 |
| ·质粒DNA的小提 | 第33页 |
| ·质粒DNA的大量提取 | 第33-34页 |
| ·重组质粒DNA浓度的测定 | 第34-35页 |
| ·DNA的纯化回收 | 第35页 |
| ·贴壁细胞培养 | 第35页 |
| ·稳定表达细胞株的构建 | 第35-36页 |
| ·细胞冻存 | 第36页 |
| ·细胞复苏 | 第36页 |
| ·细胞裂解 | 第36页 |
| ·ELISA检测方法 | 第36-37页 |
| ·Western Blotting的检测方法 | 第37-39页 |
| ·用流式细胞技术检测表达蛋白的活性 | 第39页 |
| ·蛋白提纯 | 第39-40页 |
| 3 实验结果 | 第40-50页 |
| ·优化S蛋白,并合成S蛋白基因 | 第40-43页 |
| ·将CD5L插入载体,构建质粒 | 第43页 |
| ·构建S及其片段基因的克隆,并检测 | 第43-44页 |
| ·瞬时转染细胞,检测蛋白的表达 | 第44-45页 |
| ·质粒大提 | 第45页 |
| ·构建稳定表达细胞株 | 第45页 |
| ·质粒线性化并回收线性化的DNA | 第45页 |
| ·将线性化的质粒转染细胞,构建稳定表达细胞株 | 第45页 |
| ·检测融合蛋白的正确表达,并测定表达量 | 第45-47页 |
| ·蛋白提纯 | 第47页 |
| ·融合蛋白的活性检测 | 第47-50页 |
| ·用Vero E6细胞检测融合蛋白的活性 | 第47-48页 |
| ·用转染了人源ACE2的293E细胞检测蛋白活性 | 第48-49页 |
| ·用转染了鼠源ACE2的293E细胞检测蛋白活性 | 第49-50页 |
| 讨论 | 第50-55页 |
| 第二部分 S蛋白与受体ACE2的相互作用并导致急性肺损伤的机理 | 第55-78页 |
| 4 实验材料 | 第55-56页 |
| ·实验小鼠 | 第55页 |
| ·实验仪器 | 第55页 |
| ·其它试剂 | 第55-56页 |
| 5 实验方法 | 第56-59页 |
| ·IP实验 | 第56页 |
| ·用流式细胞技术检测ACE2受体下调实验 | 第56-57页 |
| ·细胞融合实验 | 第57-58页 |
| ·肺弹性变化分析方法 | 第58-59页 |
| ·肺损伤评分方法 | 第59页 |
| ·免疫组化染色 | 第59页 |
| 6 实验结果 | 第59-70页 |
| ·S1190 Fc与ACE2受体的免疫共沉淀(IP)实验结果 | 第59-61页 |
| ·受体ACE2下调实验 | 第61-63页 |
| ·用培养细胞做ACE2受体下调实验,检测抗体为抗ACE2的抗体 | 第61-62页 |
| ·用培养细胞做ACE2受体下调实验,检测抗体为抗Fc的抗体 | 第62-63页 |
| ·细胞融合实验 | 第63-64页 |
| ·肺弹性变化分析 | 第64-66页 |
| ·小鼠肺损伤加注融合蛋白S1190 Fc的肺弹回率变化 | 第64-65页 |
| ·小鼠肺损伤加注融合蛋白S1190 Fc或S318-510 Fc的肺弹回率变化 | 第65-66页 |
| ·肺组织病理切片 | 第66-67页 |
| ·肺损伤评分 | 第67-68页 |
| ·肺组织免疫组化染色结果 | 第68-69页 |
| ·融合蛋白S1190 Fc处理过的小鼠肺组织ACE2表达量下降 | 第69-70页 |
| 讨论 | 第70-72页 |
| 小结 | 第72-75页 |
| 参考文献 | 第75-78页 |
| 第三部分 维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型的建立 | 第78-111页 |
| 前言 | 第78-81页 |
| 维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型的建立 | 第81-111页 |
| 1 实验材料 | 第81-85页 |
| ·质粒 | 第81页 |
| ·菌株 | 第81页 |
| ·工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker | 第81页 |
| ·细胞用培养基及血清 | 第81页 |
| ·细胞培养用耗材 | 第81-82页 |
| ·主要化学试剂 | 第82页 |
| ·试剂盒 | 第82页 |
| ·主要仪器及设备 | 第82-83页 |
| ·全反式维甲酸溶液的配制 | 第83页 |
| ·主要溶液配方 | 第83-85页 |
| ·E.coli用培养基的配制 | 第83页 |
| ·制备感受态细胞相关溶液 | 第83页 |
| ·抗生素的配制 | 第83-84页 |
| ·大量提取质粒DNA的相关溶液 | 第84页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及凝胶的配制 | 第84页 |
| ·细胞冻存液的配制 | 第84页 |
| ·细胞裂解液的配制 | 第84-85页 |
| ·常用缓冲液的配制 | 第85页 |
| 2 实验方法 | 第85-92页 |
| ·单链复性 | 第85页 |
| ·酶切消化 | 第85-86页 |
| ·连接 | 第86页 |
| ·转化 | 第86-87页 |
| ·鉴定 | 第87页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第87-88页 |
| ·质粒DNA的小提 | 第88页 |
| ·质粒DNA的大量提取 | 第88-90页 |
| ·重组质粒DNA浓度的测定 | 第90页 |
| ·DNA的纯化回收 | 第90页 |
| ·贴壁细胞培养 | 第90页 |
| ·稳定表达细胞株的构建 | 第90-91页 |
| ·细胞冻存 | 第91页 |
| ·细胞复苏 | 第91-92页 |
| ·细胞裂解 | 第92页 |
| ·药物筛选步骤 | 第92页 |
| 3 实验结果 | 第92-106页 |
| ·确定并合成RARE单链 | 第92-93页 |
| ·单链复性 | 第93页 |
| ·反复插入RARE,构建克隆并检测 | 第93-94页 |
| ·质粒大提 | 第94-95页 |
| ·质粒线性化并回收线性化的DNA | 第95-96页 |
| ·挑选细胞单克隆 | 第96页 |
| ·利用荧光显微镜进行第一次筛查 | 第96页 |
| ·利用流式细胞术进行第二次筛查 | 第96页 |
| ·再次利用流式细胞术进行第三次筛查 | 第96-98页 |
| ·细胞的冻存 | 第98页 |
| ·通过反复传代检测细胞株的稳定性 | 第98-99页 |
| ·反复传代后通过荧光显微镜进行检测 | 第98-99页 |
| ·反复传代后通过流式细胞术进行检测 | 第99页 |
| ·通过细胞的冻存与复苏检测细胞株的稳定性 | 第99页 |
| ·通过荧光分光光度计测定细胞模型的EC50 | 第99-103页 |
| ·通过荧光显微镜观察药物筛选细胞模型的适用性 | 第103-104页 |
| ·用无水乙醇萃取阿罗神胶囊的有效成分 | 第103页 |
| ·加入细胞,检测药物筛选细胞模型的适用性 | 第103-104页 |
| ·用药筛模型对组合化学库656个化合物进行筛选 | 第104-106页 |
| 讨论 | 第106-108页 |
| 小结 | 第108-110页 |
| 参考文献 | 第110-111页 |
| 第四部分 靶向于NF-κB通路的药物筛选细胞模型的建立及纳米材料毒性研究 | 第111-125页 |
| 1 细胞模型检测结果 | 第111-114页 |
| ·加入刺激性药物前后绿色荧光的变化 | 第111-112页 |
| ·计算药筛模型的EC50 | 第112-114页 |
| 2 建立靶向于NF-κB通路的药物筛选细胞模型的应用 | 第114-116页 |
| ·用流式细胞术检测纳米材料的毒性 | 第114-116页 |
| ·检测PAMAM G3对细胞生长状态的影响 | 第116页 |
| 3 小鼠肌肉注射PAMAM G3后的组织病理切片 | 第116-123页 |
| 讨论 | 第123-125页 |
| 综述:SARS-CoV的致病机理及研究进展 | 第125-153页 |
| 1 SARS-CoV的病理损伤 | 第126-128页 |
| 2 SARS-CoV的基因组结构及其编码的主要蛋白 | 第128-130页 |
| ·SARS-CoV的结构蛋白 | 第128-130页 |
| ·SARS-CoV的非结构蛋白 | 第130页 |
| 3 吸附蛋白与细胞受体蛋白研究进展 | 第130-135页 |
| ·病毒吸附蛋白 | 第130-132页 |
| ·细胞受体蛋白 | 第132-135页 |
| ·ACE2受体的研究 | 第132-133页 |
| ·凝集素作为潜在受体的研究 | 第133-135页 |
| 4 病毒进入细胞的方式 | 第135-136页 |
| ·直接膜融合方式 | 第135页 |
| ·内吞作用入胞 | 第135-136页 |
| 5 病毒免疫原性研究进展 | 第136-137页 |
| ·受体结合区免疫原性 | 第136-137页 |
| ·其他部位的免疫原性 | 第137页 |
| 6 机体对SARS-CoV的免疫反应 | 第137-142页 |
| ·保护性免疫反应 | 第138-140页 |
| ·免疫反应过度引起的免疫病理损伤 | 第140-142页 |
| 7 病毒感染引起机体损伤的分子生物学机理 | 第142-153页 |
| ·凋亡在疾病发生过程中的作用 | 第142-143页 |
| ·肾素血管紧张素系统在疾病中的作用 | 第143-153页 |
| ·肾素血管紧张素系统在急性肺损伤中的作用 | 第144页 |
| ·ACE2在SARS-CoV引发的肺损伤中的作用 | 第144-153页 |
| 个人简历 | 第153-155页 |
| 致谢 | 第155-158页 |
