| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 引言 | 第8-9页 |
| 第一部分 文献综述 | 第9-30页 |
| 一、人B淋巴细胞刺激因子(hBAFF)的研究进展 | 第10-18页 |
| 1 BAFF基因及蛋白结构 | 第10-11页 |
| 2 BAFF的表达 | 第11-12页 |
| 3 BAFF的受体 | 第12页 |
| 4 BAFF的生物学功能 | 第12-14页 |
| 5 BAFF刺激B细胞产生的胞内信号通路的研究 | 第14页 |
| 6 在疾病中的作用 | 第14-15页 |
| 参考文献 | 第15-18页 |
| 二、绿色萤光蛋白综述 | 第18-22页 |
| 参考文献 | 第21-22页 |
| 三、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris) | 第22-30页 |
| 1 P．pastoris宿主菌 | 第22-23页 |
| 2 酵母表达载体 | 第23-26页 |
| 2．1 载体的结构特点 | 第23-24页 |
| 2．2 载体的类型 | 第24-25页 |
| 2．3 载体的选择标志 | 第25-26页 |
| 3 外源蛋白在毕赤酵母中的表达 | 第26-27页 |
| 3．1 异源蛋白在酵母中表达的一般步骤 | 第26-27页 |
| 3．2 重组蛋白的翻译后修饰 | 第27页 |
| 4 应用前景及局限性 | 第27-29页 |
| 参考文献 | 第29-30页 |
| 第二部分 实验内容 | 第30-73页 |
| 第一章 EGFP-hBAFF融合蛋白克隆表达、纯化鉴定及相关的活性研究 | 第31-51页 |
| 摘要 | 第31-32页 |
| 1 实验材料 | 第32-33页 |
| 1．1 实验材料和试剂 | 第32页 |
| 1．2 主要实验仪器 | 第32页 |
| 1．3 主要试剂配制 | 第32-33页 |
| 2 实验设计 | 第33-34页 |
| 3 实验方法 | 第34-40页 |
| 3．1 融合蛋白载体的构建 | 第34-37页 |
| 3．1．1 PCR合成EGFP／hBAFF基因 | 第34-36页 |
| 3．1．2 DNA的酶切、连接和转化 | 第36-37页 |
| 3．2 融合蛋白的表达、鉴定和纯化 | 第37-40页 |
| 3．2．1 融合蛋白表达 | 第37-38页 |
| 3．2．2 显微镜观察 | 第38页 |
| 3．2．3 融合蛋白western blotting鉴定 | 第38-39页 |
| 3．2．4 蛋白纯化 | 第39-40页 |
| 3．3 荧光光谱测定 | 第40页 |
| 3．4 融合蛋白活性测定 | 第40页 |
| 4 实验结果 | 第40-46页 |
| 4．1 表达载体构建 | 第40-41页 |
| 4．2 表达纯化融合蛋白 | 第41-44页 |
| 4．2．1 阳性菌株的蛋白表达 | 第41-43页 |
| 4．2．2 EGFP／hBAFF融合蛋白的纯化 | 第43-44页 |
| 4．3 EGFP／hBAFF融合蛋白荧光活性测定 | 第44-45页 |
| 4．4 融合蛋白活性测定 | 第45-46页 |
| 5 讨论 | 第46-48页 |
| 参考文献 | 第48-50页 |
| Abstract | 第50-51页 |
| 第二章 人B淋巴细胞刺激因子(hBAFF)在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达和产物定 | 第51-73页 |
| 摘要 | 第51-52页 |
| 1 实验材料 | 第52-54页 |
| 1．1 实验材料和试剂 | 第52页 |
| 1．2 主要实验仪器 | 第52页 |
| 1．3．主要试剂配制 | 第52-53页 |
| 1．4 培养基的配制 | 第53-54页 |
| 2 实验设计 | 第54-55页 |
| 3 实验方法 | 第55-63页 |
| 3．1 PCR合成hBAFF基因 | 第55-56页 |
| 3．1．1 合成hBAFF基因引物序列 | 第55页 |
| 3．1．2 PCR反应体系 | 第55-56页 |
| 3．1．3 引物延伸条件 | 第56页 |
| 3．2 质粒pPIC9的提取与纯化 | 第56页 |
| 3．3 用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切质粒pPIC9,并纯化回收 | 第56-57页 |
| 3．4 连接 | 第57页 |
| 3．5 转化 | 第57-58页 |
| 3．5．1 感受态细胞的制备 | 第57页 |
| 3．5．2 连接产物的转化 | 第57-58页 |
| 3．6 双酶切鉴定及测序 | 第58页 |
| 3．7 宿主菌的转化 | 第58-60页 |
| 3．7．1 质粒的提取 | 第58页 |
| 3．7．2 质粒的线性化 | 第58页 |
| 3．7．3 线性化质粒的纯化与鉴定 | 第58页 |
| 3．7．4 酵母GS115宿主感受态细胞的制备 | 第58-59页 |
| 3．7．5 电转化 | 第59页 |
| 3．7．6 PCR鉴定阳性克隆 | 第59-60页 |
| 3．7．7 重组菌株Mut表型鉴定 | 第60页 |
| 3．8 重组菌株的甲醇诱导表达 | 第60页 |
| 3．9 表达产物鉴定 | 第60-61页 |
| 3．9．1 SDS-PAGE鉴定 | 第60页 |
| 3．9．2 Western blotting鉴定 | 第60-61页 |
| 3．10 表达条件的优化 | 第61-62页 |
| 3．11 ELISA检测不同表达时间、不同温度的蛋白表达量 | 第62-63页 |
| 4 实验结果 | 第63-67页 |
| 4．1 hBAFF基因的扩增 | 第63页 |
| 4．2 重组表达载体的构建 | 第63-64页 |
| 4．3 电转化 | 第64-65页 |
| 4．4 hBAFF蛋白的诱导表达 | 第65-67页 |
| 4．4．1 不同诱导时间蛋白表达的SDS-PAGE | 第65页 |
| 4．4．2 诱导72小时后表达上清的Western blotting检测 | 第65-66页 |
| 4．4．3 不同诱导时间和温度ELISA检测结果 | 第66-67页 |
| 4．5 真核与原核表达量的不同 | 第67页 |
| 5 讨论 | 第67-69页 |
| 参考文献 | 第69-71页 |
| Abstract | 第71-73页 |
| 全文总结 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 附1 | 第75页 |
