| 中文摘要 | 第1-8页 |
| 英文摘要 | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-18页 |
| 一、hTNFα基因的定点突变及其基因克隆 | 第18-35页 |
| 1、材料 | 第18-19页 |
| 2、方法 | 第19-30页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第19-20页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第20页 |
| ·质粒DNA的纯化 | 第20-22页 |
| ·引物的设计 | 第22-23页 |
| ·PCR引导的突变原理及程序 | 第23-26页 |
| ·扩增产物的检测 | 第26页 |
| ·PCP产物的抽提 | 第26页 |
| ·PCR产物及pUC19质粒DNA的酶切 | 第26-27页 |
| ·PCR扩增片段及pUC19酶切后的回收 | 第27页 |
| ·基因与载体的连接 | 第27页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| ·转化 | 第28页 |
| ·重组质粒的筛选和鉴定 | 第28-29页 |
| ·核苷酸序列测定 | 第29-30页 |
| 3、结果 | 第30-35页 |
| ·PCR引导的定点突变 | 第30-32页 |
| ·重组质粒的构建 | 第32-33页 |
| ·筛选出的阳性重组质粒的核苷酸序列分析 | 第33-35页 |
| 二、hTNFα及其突变体在大肠杆菌中的表达研究 | 第35-43页 |
| 1、材料 | 第35-36页 |
| 2、方法 | 第36-39页 |
| ·表达质粒的构建 | 第36-37页 |
| ·重组表达质粒的筛选及鉴定 | 第37页 |
| ·菌种的保存 | 第37-38页 |
| ·外源基因的诱导表达 | 第38页 |
| ·蛋白质的SDS-PAGE电泳 | 第38-39页 |
| 3、结果 | 第39-43页 |
| ·pBV220-hTNFα表达质粒的构建 | 第39页 |
| ·重组表达质粒的酶切图谱鉴定 | 第39-40页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第40-43页 |
| 三、hTNFα及其突变体表达产物的分离纯化研究 | 第43-53页 |
| 1、材料 | 第43页 |
| 2、方法 | 第43-46页 |
| ·以可溶性形式表达的蛋白的分离纯化 | 第43-45页 |
| ·以包涵体形式表达的蛋白的分离纯化 | 第45-46页 |
| 3、结果 | 第46-53页 |
| ·可溶性蛋白纯化结果 | 第46-51页 |
| ·包涵体蛋白纯化结果 | 第51-53页 |
| 四、rhTNFα及其突变体的蛋白样品鉴定 | 第53-60页 |
| 1、材料 | 第53页 |
| 2、方法 | 第53-57页 |
| ·蛋白质含量的测定 | 第53-54页 |
| ·蛋白质纯度的鉴定 | 第54页 |
| ·表达产物的Western-blot检测 | 第54-56页 |
| ·rhTNFα及其突变体表达产物构象分析 | 第56-57页 |
| 3、结果 | 第57-60页 |
| ·蛋白质的含量及纯度鉴定 | 第57页 |
| ·Western Blot检测 | 第57-58页 |
| ·免疫沉淀结果 | 第58-60页 |
| 五、rhTNFα及其突变体蛋白的体内、外活性检测 | 第60-65页 |
| 1、材料 | 第60页 |
| 2、方法 | 第60-61页 |
| ·体外活性测定 | 第60页 |
| ·体内活性测定 | 第60-61页 |
| 3、结果 | 第61-65页 |
| ·rhTNFα及其突变体对L929细胞的细胞毒作用 | 第61-62页 |
| ·rhTNFα及其突变体的毒性比较 | 第62-63页 |
| ·rhTNFα及其突变体致肿瘤组织出血坏死效应的比较 | 第63-65页 |
| 六、rhTNFα及其突变体刺激细胞的基因反应分析 | 第65-75页 |
| 1、材料 | 第65-66页 |
| 2、方法 | 第66-70页 |
| ·rhTNFα及其突变体刺激L929细胞 | 第66-67页 |
| ·被刺激细胞mRNA的提取 | 第67页 |
| ·cDNA第一链合成 | 第67-68页 |
| ·mRNA差异显示分析 | 第68-69页 |
| ·PCR产物测序 | 第69-70页 |
| ·几种癌基因及程序化死亡调控相关基因的特异性差异显示分析 | 第70页 |
| 3、结果 | 第70-75页 |
| ·rhTNFα及其突变体蛋白刺激细胞后的非特异性mRNA差异显示分析 | 第70-71页 |
| ·差异DNA片段的序列分析 | 第71-72页 |
| ·几种原癌基因及程序化死亡调控相关基因的特异性mRNA差异显示分析 | 第72-75页 |
| 讨论 | 第75-91页 |
| 小结 | 第91-92页 |
| 论文参考文献 | 第92-99页 |
| 综述 | 第99-118页 |
| 综述参考文献 | 第112-118页 |
| 附录 | 第118-124页 |
| 致谢 | 第124-125页 |
| 个人简历 | 第125页 |
