| 中文摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-13页 |
| 1.前言 | 第13-27页 |
| ·β-内酰胺类药物及抗菌机理 | 第14-15页 |
| ·细菌对β-内酰胺类药物的耐药机理及β-内酰胺酶的分类 | 第15-16页 |
| ·超广谱β-内酰胺酶分类概述 | 第16-18页 |
| ·CTX-M型超广谱β-内酰胺酶研究进展 | 第18-25页 |
| ·CTX-M型ESBLs分子结构特性 | 第18-20页 |
| ·CTX-M型ESBLs分子生物学特征 | 第20-23页 |
| ·CTX-M型ESBLs的分类与分布 | 第23-25页 |
| ·CTX-M型ESBLs的传播 | 第25页 |
| ·本研究的前期工作基础 | 第25-26页 |
| ·本研究的目的意义及创新点 | 第26-27页 |
| ·技术路线 | 第27页 |
| 2.材料 | 第27-30页 |
| ·菌株和载体 | 第27-28页 |
| ·培养基 | 第28页 |
| ·主要试剂 | 第28-29页 |
| ·主要仪器 | 第29-30页 |
| 3.方法 | 第30-39页 |
| ·CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因的PCR扩增、克隆与序列分析 | 第30-35页 |
| ·CTX-M-1型全基因PCR扩增引物设计 | 第30页 |
| ·菌株的培养 | 第30页 |
| ·全基因PCR扩增 | 第30-31页 |
| ·PCR扩增产物的回收 | 第31-32页 |
| ·PCR产物与pGM-T载体的连接 | 第32页 |
| ·连接产物转化E.coli DH5a | 第32-33页 |
| ·重组克隆质粒的鉴定 | 第33-34页 |
| ·基因生物信息学分析 | 第34-35页 |
| ·超广谱β-内酰胺酶CTX-M型基因的原核表达 | 第35-37页 |
| ·pET-30b(+)/CTX-M重组表达质粒的构建 | 第35-36页 |
| ·pET-30b(+)/CTX-M重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第36页 |
| ·重组菌的药敏测定 | 第36页 |
| ·重组表达产物的可溶性检测 | 第36-37页 |
| ·重组蛋白酶原核表达条件的优化 | 第37页 |
| ·重组蛋白酶对β-内酰胺类抗生素的作用及动力学特征 | 第37-39页 |
| ·β-内酰胺酶初提液的制备 | 第37页 |
| ·确定各底物的最佳波长 | 第37-38页 |
| ·酶对抗生素作用的测定 | 第38页 |
| ·酶的米氏常数(Km)和最大反应速度(V_(max))的求取 | 第38页 |
| ·pH、温度、底物浓度对酶反应速度的影响 | 第38-39页 |
| 4.结果 | 第39-53页 |
| ·CTX-M型ESBLs全基因的扩增、克隆与序列分析结果 | 第39-44页 |
| ·全基因PCR产物电泳结果 | 第39页 |
| ·重组克隆质粒的鉴定结果 | 第39-40页 |
| ·基因生物信息学分析结果 | 第40-44页 |
| ·CTX-M-69型ESBLs的原核表达结果 | 第44-49页 |
| ·pET-30b(+)/CTX-M-69表达质粒的构建结果 | 第44-45页 |
| ·重组菌的药敏实验结果 | 第45-46页 |
| ·CTX-M-69型ESBLs重组蛋白的诱导表达和可溶性检测 | 第46-47页 |
| ·CTX-M-69型ESBLs重组蛋白原核表达条件的优化结果 | 第47-49页 |
| ·重组蛋白对β-内酰胺类抗生素的作用及动力学特征 | 第49-53页 |
| ·酶对12种β-内酰胺类抗生素作用结果 | 第49-50页 |
| ·酶的动力学特征 | 第50页 |
| ·pH、温度、底物浓度对酶反应速度的影响 | 第50-53页 |
| 5.讨论 | 第53-59页 |
| ·CTX-M-69基因的发现 | 第53-54页 |
| ·CTX-M型ESBLs流行病学多样性 | 第54页 |
| ·表达载体的选择 | 第54-55页 |
| ·重组蛋白原核表达条件的优化 | 第55-56页 |
| ·CTX-M-69野生菌和基因工程菌耐药表型变化比较 | 第56页 |
| ·酶学性质 | 第56-58页 |
| ·氨基酸残基的改变对酶活性的影响 | 第58-59页 |
| 6.结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 附录 | 第66页 |
