| 目录 | 第1-11页 |
| 中文摘要 | 第11-17页 |
| ABSTRACT | 第17-24页 |
| 符号说明 | 第24-26页 |
| 第一章 研究背景与立题依据 | 第26-55页 |
| ·研究背景 | 第26-52页 |
| ·金属蛋白酶及分类 | 第26-28页 |
| ·蛋白酶及其分类 | 第26-27页 |
| ·金属蛋白酶及其在MEROPS数据库中的分类 | 第27-28页 |
| ·Thermolysin家族 | 第28-39页 |
| ·来源与分类 | 第28-31页 |
| ·结构特征 | 第31-34页 |
| ·成熟机制 | 第34页 |
| ·底物特异性 | 第34-36页 |
| ·活性和热稳定性 | 第36-37页 |
| ·生物学功能及应用 | 第37-38页 |
| ·Vibriolysin | 第38-39页 |
| ·适冷酶及适冷机制 | 第39-48页 |
| ·适冷微生物及适冷机制 | 第39-40页 |
| ·已报道的适冷酶 | 第40页 |
| ·适冷酶的高催化效率 | 第40-42页 |
| ·适冷酶的K_m | 第42-43页 |
| ·适冷酶的稳定性 | 第43-45页 |
| ·适冷酶的柔性 | 第45-47页 |
| ·适冷酶的结构特征 | 第47-48页 |
| ·活性—稳定性—柔性三者之间的关系 | 第48页 |
| ·来自深海沉积物的P.sp.SM9913及其对深海极端环境的生态适应机制 | 第48-51页 |
| ·P.sp.SM9913胞外蛋白酶的多样性及其适应机制 | 第49-50页 |
| ·P.sp.SM9913的对深海极端环境的生态适应机制探讨 | 第50-51页 |
| ·来自北极海冰的P.sp.SM495的胞外蛋白酶 | 第51-52页 |
| ·立题依据与研究内容 | 第52-55页 |
| ·立题依据 | 第52-53页 |
| ·研究内容 | 第53-55页 |
| 第二章 深海适冷菌P.sp.SM9913所产蛋白酶MCP-02的基因克隆、重组表达和性质研究 | 第55-87页 |
| ·实验材料、仪器和软件 | 第55-58页 |
| ·菌株与质粒 | 第55页 |
| ·培养基 | 第55-56页 |
| ·主要分子试剂和试剂盒 | 第56页 |
| ·主要生化试剂、药品 | 第56页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第56-57页 |
| ·数据库及分析软件 | 第57-58页 |
| ·实验方法 | 第58-65页 |
| ·菌株的培养 | 第58页 |
| ·菌株与质粒的保存 | 第58页 |
| ·适冷菌P.sp.SM9913产的MCP-02的分离纯化 | 第58页 |
| ·MCP-02的N端蛋白序列的测定 | 第58-59页 |
| ·蛋白酶MCP-02的基因克隆 | 第59-61页 |
| ·引物设计 | 第59页 |
| ·PCR反应体系及反应程序 | 第59-60页 |
| ·基因克隆中的其他操作 | 第60-61页 |
| ·蛋白酶MCP-02在E.coli中的表达 | 第61-62页 |
| ·重组蛋白酶MCP-02的分离纯化 | 第62页 |
| ·蛋白酶酶活的测定 | 第62-64页 |
| ·以酪蛋白为底物测定酶活 | 第62-63页 |
| ·以合成二肽为底物测定酶活 | 第63-64页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第64页 |
| ·电泳 | 第64-65页 |
| ·MALDI-TOF质谱测定MCP-02的分子量 | 第65页 |
| ·结果与分析 | 第65-84页 |
| ·适冷菌P.sp.SM9913产蛋白酶MCP-02的N端序列的测定 | 第65-66页 |
| ·蛋白酶MCP-02的基因克隆 | 第66-74页 |
| ·第一步,MCP-02保守区编码基因序列的克隆 | 第66-70页 |
| ·第二步,MCP-02 N端编码基因序列的克隆 | 第70-71页 |
| ·第三步,MCP-02 C端编码基因序列的克隆 | 第71-72页 |
| ·第四步,蛋白酶MCP-02全基因序列的拼接及序列的验证 | 第72-74页 |
| ·蛋白酶MCP-02的序列分析 | 第74-76页 |
| ·利用BLAST工具搜索公共数据库中的相似序列 | 第74页 |
| ·MCP-02的序列、结构域及关键位点分析 | 第74-76页 |
| ·利用MEROPS数据库对MCP-02进行分类 | 第76页 |
| ·MCP-02在E.coli中的表达和分离纯化 | 第76-78页 |
| ·重组蛋白酶MCP-02的基本酶学性质 | 第78-84页 |
| ·最适pH | 第78-79页 |
| ·最适酶活温度 | 第79页 |
| ·半衰期 | 第79-80页 |
| ·金属离子和抑制剂的影响 | 第80-81页 |
| ·底物特异性 | 第81-84页 |
| ·讨论 | 第84-87页 |
| 第三章 北极海冰细菌P.sp.SM495所产胞外蛋白酶E495的基因克隆、重组表达和性质研究 | 第87-110页 |
| ·实验材料、仪器和软件 | 第87-88页 |
| ·菌株与质粒 | 第87页 |
| ·培养基 | 第87页 |
| ·主要分子试剂和试剂盒 | 第87页 |
| ·主要生化试剂与药品 | 第87页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第87页 |
| ·数据库及分析软件 | 第87-88页 |
| ·实验方法 | 第88-90页 |
| ·菌株的培养 | 第88页 |
| ·菌株与质粒的保存 | 第88页 |
| ·E495的N端氨基酸序列的测定 | 第88页 |
| ·蛋白酶E495的基因克隆 | 第88页 |
| ·蛋白酶E495在E.coli中的表达 | 第88页 |
| ·重组蛋白酶E495的分离纯化 | 第88-89页 |
| ·蛋白酶酶活的测定 | 第89页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第89页 |
| ·电泳 | 第89页 |
| ·MALDI-TOF质谱测定E495的分子量 | 第89-90页 |
| ·结果与分析 | 第90-108页 |
| ·E495的基因克隆 | 第90-93页 |
| ·蛋白酶E495的序列分析 | 第93-95页 |
| ·利用BLAST工具搜索公共数据库中的相似序列 | 第93页 |
| ·E495的序列、结构域及关键位点分析 | 第93-95页 |
| ·利用MEROPS数据库对E495进行家族分类 | 第95页 |
| ·蛋白酶E495在E.coli中的表达和分离纯化 | 第95-103页 |
| ·重组蛋白酶E495发酵条件的优化 | 第95-101页 |
| ·重组蛋白酶E495的分离纯化 | 第101-103页 |
| ·重组蛋白酶E495的基本酶学性质 | 第103-108页 |
| ·最适pH | 第103页 |
| ·最适酶活温度 | 第103页 |
| ·热稳定性 | 第103-105页 |
| ·金属离子对酶活的影响 | 第105页 |
| ·底物特异性 | 第105-108页 |
| ·讨论 | 第108-110页 |
| 第四章 Thermolysin家族适冷酶的适冷机制 | 第110-135页 |
| ·实验材料、仪器和软件 | 第110-111页 |
| ·菌株与质粒 | 第110页 |
| ·培养基 | 第110页 |
| ·主要分子试剂、生化试剂和试剂盒 | 第110页 |
| ·主要仪器 | 第110-111页 |
| ·数据库及分析软件 | 第111页 |
| ·实验方法 | 第111-114页 |
| ·菌株的培养 | 第111页 |
| ·菌株与质粒的保存 | 第111页 |
| ·Pseudolysin在E.coli中的表达 | 第111-112页 |
| ·重组蛋白酶pseudolysin的分离纯化 | 第112页 |
| ·蛋白质N端序列的测定 | 第112页 |
| ·光谱性质的测定 | 第112-113页 |
| ·圆二色光谱 | 第112页 |
| ·荧光光谱 | 第112页 |
| ·荧光淬灭实验 | 第112-113页 |
| ·蛋白酶酶活的测定 | 第113页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第113页 |
| ·电泳 | 第113页 |
| ·同源模建 | 第113-114页 |
| ·结果与分析 | 第114-129页 |
| ·Pseudolysin的重组表达、分离纯化和性质研究 | 第114-120页 |
| ·Pseudolysin的重组表达和分离纯化 | 第114-115页 |
| ·重组蛋白酶pseudolysin的基本酶学性质 | 第115-120页 |
| ·Pseudolysin、MCP-02和E495的活性、热稳定性和柔性的比较 | 第120-125页 |
| ·活性比较 | 第120-121页 |
| ·热稳定性比较 | 第121-123页 |
| ·柔性比较 | 第123-125页 |
| ·Pseudolysin、MCP-02、E495的序列和结构比较 | 第125-129页 |
| ·序列比较 | 第125-127页 |
| ·结构比较 | 第127-129页 |
| ·讨论 | 第129-135页 |
| ·催化效率 | 第129页 |
| ·热稳定性 | 第129-130页 |
| ·柔性 | 第130页 |
| ·活性—柔性—稳定性三者之间的关系 | 第130-133页 |
| ·Thermolysin家族适冷进化的能量景观模型 | 第133-135页 |
| 第五章 P.sp.SM9913分泌的胞外蛋白酶对多肽和大分子蛋白的降解 | 第135-151页 |
| ·实验材料、仪器和软件 | 第135-136页 |
| ·试剂、药品与耗材 | 第135-136页 |
| ·主要仪器 | 第136页 |
| ·数据库及分析软件 | 第136页 |
| ·实验方法 | 第136-138页 |
| ·蛋白酶的分离纯化 | 第136页 |
| ·蛋白酶酶解insulin B_(ox)底物 | 第136-137页 |
| ·蛋白酶酶解BSA底物 | 第137-138页 |
| ·结果与分析 | 第138-148页 |
| ·MCP-01、MCP-02和MCP-03对insulin B_(ox)的切点分析 | 第138-146页 |
| ·MCP-01对insulin B_(ox)的切点分析 | 第138-141页 |
| ·MCP-02对insulin B_(ox)的切点分析 | 第141-143页 |
| ·MCP-03对insulin B_(ox)的切点分析 | 第143-145页 |
| ·MCP-01、MCP-02和MCP-03对insulin B_(ox)的切点的综合分析 | 第145-146页 |
| ·MCP-01、MCP-02和MCP-03对BSA的切点分析 | 第146-148页 |
| ·讨论 | 第148-151页 |
| 全文总结与展望 | 第151-154页 |
| 参考文献 | 第154-170页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第170-171页 |
| 致谢 | 第171-172页 |
| 附件 | 第172-205页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第205页 |
