| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 前言 | 第10-15页 |
| 1 几丁质和壳聚糖 | 第10页 |
| 2 几丁质脱乙酰化酶的分类 | 第10-12页 |
| 3 去乙酰化产物的结构鉴定 | 第12-13页 |
| 4 壳聚糖在真菌细胞壁中的作用 | 第13-14页 |
| 5 本论文的研究目的及意义 | 第14-15页 |
| 第二章 灰盖鬼伞细胞壁中GlcNAc和GlcN含量的分析 | 第15-19页 |
| 1 材料和方法 | 第15-17页 |
| 1.1 实验材料 | 第15页 |
| 1.2 培养基及培养条件 | 第15页 |
| 1.3 灰盖鬼伞细胞壁的提取 | 第15-16页 |
| 1.4 细胞壁中GlcNAc和GlcN含量的测定 | 第16页 |
| 1.5 3-methyl-2-benzothiazolone-hydrazone-hydrochloride( MBTH)法分析 | 第16-17页 |
| 2 结果 | 第17-19页 |
| 2.1 MBTH的标准曲线 | 第17页 |
| 2.2 细胞壁中GlcNAc和GlcN的含量 | 第17-19页 |
| 第三章 灰盖鬼伞中几丁质脱乙酰化酶的表达分析和异源重组表达 | 第19-44页 |
| 第一节 灰盖鬼伞中几丁质脱乙酰化酶的表达水平分析 | 第19-24页 |
| 1 材料和方法 | 第19-22页 |
| 1.1 实验材料 | 第19页 |
| 1.2 培养基及试剂 | 第19页 |
| 1.3 实验仪器 | 第19页 |
| 1.4 灰盖鬼伞的培养 | 第19-20页 |
| 1.5 灰盖鬼伞总RNA的提取及cDNA的合成 | 第20-21页 |
| 1.6 灰盖鬼伞基因组中几丁质脱乙酰化酶的表达分析 | 第21-22页 |
| 2 结果 | 第22-24页 |
| 2.1 灰盖鬼伞中几丁质脱乙酰化酶在菌柄不同部位的表达分析 | 第22-23页 |
| 2.2 讨论 | 第23-24页 |
| 第二节 灰盖鬼伞几丁质脱乙酰化酶的异源重组表达 | 第24-42页 |
| 1 材料与方法 | 第24-36页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第24页 |
| 1.2 试剂和仪器 | 第24-25页 |
| 1.3 培养基的配制 | 第25-26页 |
| 1.4 灰盖鬼伞子实体的培养 | 第26页 |
| 1.5 灰盖鬼伞菌柄总RNA的提取和cDNA的合成 | 第26-27页 |
| 1.6 引物的设计和合成 | 第27页 |
| 1.7 几丁质脱乙酰化酶基因的PCR扩增 | 第27-28页 |
| 1.8 PCR扩增产物的检测及胶回收 | 第28-29页 |
| 1.9 质粒pPICZαA的提取和双酶切 | 第29-30页 |
| 1.10 感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| 1.11 重组质粒的构建和感受态细胞的转化 | 第31页 |
| 1.12 阳性克隆的筛选 | 第31-32页 |
| 1.13 重组质粒的提取及线性化 | 第32页 |
| 1.14 毕赤酵母的电转 | 第32-33页 |
| 1.15 阳性转化子的筛选 | 第33-34页 |
| 1.16 几丁质脱乙酰化酶的诱导表达 | 第34-35页 |
| 1.17 几丁质脱乙酰化酶的亲和层析纯化 | 第35页 |
| 1.18 组蛋白的SDS-PAGE检测 | 第35-36页 |
| 2 结果 | 第36-42页 |
| 2.1 几丁质脱乙酰化酶扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及纯化 | 第36-37页 |
| 2.2 质粒pPICZαA的双酶切验证 | 第37页 |
| 2.3 重组表达质粒的构建 | 第37-38页 |
| 2.4 E.coli DH5α转化子的菌落PCR验证 | 第38-39页 |
| 2.5 Pichia Pastoris GS115阳性克隆的菌落PCR验证 | 第39页 |
| 2.6 重组蛋白的亲和层析和SDS-PAGE检测 | 第39-42页 |
| 第三节 灰盖鬼伞中几丁质脱乙酰化酶酶活性的检测 | 第42-44页 |
| 1 材料与方法 | 第42-43页 |
| 1.1 试剂与仪器 | 第42页 |
| 1.2 Cda酶活性的测定 | 第42-43页 |
| 2 结果 | 第43-44页 |
| 第四章 灰盖鬼伞中几丁质脱乙酰化酶Cda1和Cda2的酶学特性和功能的研究 | 第44-73页 |
| 第一节 灰盖鬼伞中几丁质脱乙酰化酶Cda2的酶学特性 | 第44-49页 |
| 1 材料与方法 | 第44-45页 |
| 1.1 试剂与仪器 | 第44页 |
| 1.2 Cda2最适pH和pH稳定性的检测 | 第44-45页 |
| 1.3 Cda2最适温度和温度稳定性的测定 | 第45页 |
| 1.4 金属离子和化学试剂对酶活性的影响 | 第45页 |
| 1.5 Cda2的底物特异性 | 第45页 |
| 2 结果 | 第45-49页 |
| 2.1 Cda2最适pH和pH稳定性的测定 | 第45-46页 |
| 2.2 Cda2最适温度和温度稳定性的测定 | 第46-47页 |
| 2.3 金属离子和化学试剂对酶活性的影响 | 第47页 |
| 2.4 Cda2的底物特异性 | 第47-49页 |
| 第二节 几丁质脱乙酰化酶Cda1和Cda2脱乙酰化方式的研究 | 第49-70页 |
| 1 材料与方法 | 第49-50页 |
| 1.1 菌株 | 第49页 |
| 1.2 试剂与仪器 | 第49页 |
| 1.3 Cda1和Cda2对几丁质寡糖脱乙酰化方式的研究 | 第49页 |
| 1.4 MS和MS/MS分析 | 第49-50页 |
| 1.5 进化树分析 | 第50页 |
| 1.6 蛋白结构分析 | 第50页 |
| 2 结果 | 第50-70页 |
| 2.1 Cda1和Cda2对几丁质寡糖脱乙酰化方式的研究 | 第50-67页 |
| 2.1.1 Cda1和Cda2对(GlcNAc)2去乙酰化产物的MS/MS分析 | 第50-51页 |
| 2.1.2 Cdal和Cda2对(GlcNAc)3去乙酰化产物的MS/MS分析 | 第51-54页 |
| 2.1.3 Cdal和Cda2对(GlcNAc)4去乙酰化产物的MS/MS分析 | 第54-55页 |
| 2.1.4 Cdal和Cda2对(GlcNAc)5去乙酰化产物的MS/MS分析 | 第55-61页 |
| 2.1.5 Cda1和Cda2对(GlcNAc)6去乙酰化产物的MS/MS分析 | 第61-67页 |
| 2.2 氨基酸序列分析和酶结构 | 第67-70页 |
| 第三节 讨论 | 第70-73页 |
| 第五章 全文总结 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第81-82页 |
| 致谢 | 第82页 |
