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马传染性贫血病毒感染靶细胞后差异表达microRNA的研究

摘要第3-4页
abstract第4页
1 前言第10-15页
    1.1 EIAV生物学特征第11-12页
        1.1.1 EIAV形态结构第11页
        1.1.2 EIAV基因组结构第11-12页
        1.1.3 EIAV的细胞嗜性和在感染动物体内的组织分布第12页
    1.2 马传染性贫血的致病性第12-13页
    1.3 microRNA概述第13-14页
        1.3.1 microRNA与病毒第13页
        1.3.2 miRNA生成过程和作用机制第13-14页
        1.3.3 miRNA检测第14页
    1.4 本研究的目的和意义第14-15页
2 实验材料第15-17页
    2.1 试验动物第15页
    2.2 病毒株和细胞第15页
    2.3 主要试剂和质粒第15页
    2.4 主要仪器第15页
    2.5 主要溶液配置第15-17页
3 试验方法第17-29页
    3.1 eMDM的培养及病毒感染第17页
    3.2 293T细胞的培养第17页
    3.3 RNA的提取第17-18页
        3.3.1 病毒RNA的提取第17页
        3.3.2 病毒生长曲线的建立第17-18页
    3.4 间接免疫荧光检测细胞感染率第18页
    3.5 EIAVDLV34感染eMDM的miRNA表达谱的测定第18-19页
        3.5.1 细胞RNA的提取第18-19页
        3.5.2 小RNA文库构建及高通量测序第19页
    3.6 荧光定量PCR验证高通量测序结果第19页
    3.7 差异表达microRNA的生物信息学分析第19页
    3.8 eMDM中高表达miR-92a对EIAV复制的影响第19-20页
    3.9 EIAV反转录酶活性的检测第20页
    3.10 293T细胞中高表达和miR-92a对EIAV-luc表达的影响第20-21页
    3.11 miRNA激活宿主炎症反应试验第21-22页
    3.12 荧光素酶报告系统验证miRNA的靶位点第22-23页
        3.12.1 miRNA与EIAV基因组互作验证第22页
        3.12.2 miRNA与宿主基因互作验证第22-23页
    3.13 miRNA靶基因的mRNA水平检测第23-24页
    3.14 EIAVDLV34感染eMDM后miRNA靶基因mRNA水平检测第24页
    3.15 miRNA靶基因的克隆第24-26页
        3.15.1 质粒的转化第24-25页
        3.15.2 摇菌第25页
        3.15.3 菌液PCR鉴定第25页
        3.15.4 核酸凝胶电泳检测目的条带的扩增观察第25页
        3.15.5 阳性克隆的测序及序列比对第25-26页
        3.15.6 质粒的提取第26页
    3.16 WesternBlot检测靶基因的表达第26-27页
        3.16.1 293T细胞的培养及转染第26-27页
        3.16.2 WesternBlot检测蛋白表达第27页
    3.17 miRNA靶基因过表达及再感染试验第27页
    3.18 靶基因CD69的KnockDown试验及病毒再感染试验第27-29页
4 结果第29-42页
    4.1 病毒生长曲线第29页
    4.2 细胞感染率第29-30页
    4.3 microRNA差异表达谱第30页
    4.4 荧光定量PCR验证差异表达的miRNA结果第30-31页
    4.5 差异表达miRNA的生物信息学功能预测结果第31-33页
    4.6 高表达miR-92a对EIAV复制影响结果第33-34页
    4.7 EIAV反转录酶活性检测结果第34-35页
    4.8 293T细胞中高表达miR-92a对EIAV-luc表达的影响第35页
    4.9 宿主细胞炎症反应激活结果第35-36页
    4.10 荧光素酶报告系统验证结果第36-38页
        4.10.1 miRNA和EIAV基因组互作验证结果第36-37页
        4.10.2 miRNA与宿主互作验证结果第37-38页
    4.11 miR-92a靶基因CD69的mRNA水平检测结果第38-39页
    4.12 EIAVDLV34感染eMDM后靶基因CD69mRNA水平检测结果第39页
    4.13 靶基因CD69的克隆及表达结果第39-40页
    4.14 CD69过表达及再感染试验结果第40页
    4.15 靶基因CD69的KnockDown试验及病毒再感染试验第40-42页
        4.15.1 siRNA筛选及干扰效果第40-41页
        4.15.2 CD69进行KnockDown试验后的病毒再感染试验第41-42页
5 讨论第42-45页
6 结论第45-46页
7 展望第46-47页
致谢第47-48页
参考文献第48-52页
作者简介第52页

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