| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 前言 | 第13-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-41页 |
| 1.1 微生物的耐热机制 | 第15-20页 |
| 1.1.1 芽孢 | 第15-16页 |
| 1.1.2 特殊的细胞膜结构 | 第16页 |
| 1.1.3 DNA和RNA的稳定性 | 第16-17页 |
| 1.1.4 嗜热菌蛋白质及其空间结构 | 第17-18页 |
| 1.1.5 嗜热酶 | 第18页 |
| 1.1.6 嗜热菌热激蛋白 | 第18-19页 |
| 1.1.7 嗜热菌各种热激蛋白的协同作用 | 第19-20页 |
| 1.2 酿酒酵母的耐热研究 | 第20-28页 |
| 1.2.1 酵母的热敏感性 | 第21页 |
| 1.2.2 酵母的耐热性 | 第21页 |
| 1.2.3 热激对酵母壁膜系统的影响 | 第21-22页 |
| 1.2.4 酿酒酵母的热激反应途径 | 第22-24页 |
| 1.2.5 酿酒酵母热激蛋白 | 第24-25页 |
| 1.2.6 海藻糖参与酵母耐热机制 | 第25页 |
| 1.2.7 其他胁迫相关物质在酵母耐热中的作用 | 第25-26页 |
| 1.2.8 常用的酿酒酵母耐热性改造方法 | 第26-27页 |
| 1.2.9 新型的酿酒酵母耐热性改造方法 | 第27-28页 |
| 1.3 热激蛋白种类与功能 | 第28-31页 |
| 1.3.1 热激蛋白分类及生物学特性 | 第28-29页 |
| 1.3.2 热激蛋白的作用 | 第29-30页 |
| 1.3.3 分子伴侣 | 第30-31页 |
| 1.3.4 热激蛋白参与酵母抗逆共同机制 | 第31页 |
| 1.4 DNA拼接与组装技术 | 第31-39页 |
| 1.4.1 基于酵母同源重组的体内拼接方法 | 第32页 |
| 1.4.2 内切酶诱导的迭代拼接 | 第32-33页 |
| 1.4.3 枯草芽孢杆菌同源重组拼接方法 | 第33页 |
| 1.4.4 寡核苷酸链的拼接方法 | 第33-34页 |
| 1.4.5 SLIC (Sequence and ligation-independent cloning)及其改进版 | 第34页 |
| 1.4.6 基于重叠序列和聚合酶延伸的体外连接方法 | 第34-35页 |
| 1.4.7 基于限制性内切酶和连接酶的体外连接方法 | 第35-38页 |
| 1.4.8 Gibson体外同源重组拼接法 | 第38-39页 |
| 1.5 本课题的研究意义 | 第39-41页 |
| 1.5.1 选题依据 | 第39-40页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第40-41页 |
| 第二章 微生物耐热元件的发掘与表征 | 第41-77页 |
| 引言 | 第41页 |
| 2.1 材料 | 第41-46页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第41页 |
| 2.1.2 药品与试剂 | 第41-43页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第43-44页 |
| 2.1.4 培养基 | 第44页 |
| 2.1.5 主要溶液 | 第44-46页 |
| 2.2 方法 | 第46-67页 |
| 2.2.1 菌株活化 | 第46页 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第46-47页 |
| 2.2.3 大肠杆菌细胞的热激转化 | 第47页 |
| 2.2.4 酿酒酵母基因组DNA的提取 | 第47页 |
| 2.2.5 嗜热栖热菌基因组DNA的提取 | 第47-48页 |
| 2.2.6 耐热元器件的设计与组装 | 第48-58页 |
| 2.2.7 单功能耐热元器件重组质粒的构建 | 第58-59页 |
| 2.2.8 大肠杆菌质粒的提取 | 第59页 |
| 2.2.9 酿酒酵母感受态细胞的制备 | 第59-60页 |
| 2.2.10酿酒酵母电击转化 | 第60页 |
| 2.2.11单功能耐热酿酒酵母工程菌的构建 | 第60-61页 |
| 2.2.12 酿酒酵母质粒的提取（博迈得质粒提取试剂盒） | 第61页 |
| 2.2.13酿酒酵母RNA的提取 | 第61-62页 |
| 2.2.14 RNA的反转录 | 第62-63页 |
| 2.2.15 qRT-PCR | 第63-66页 |
| 2.2.16酿酒酵母工程菌梯度升温培养 | 第66页 |
| 2.2.17酿酒酵母工程菌恒定高温培养 | 第66-67页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第67-76页 |
| 2.3.1 耐热基因的挖掘 | 第67-68页 |
| 2.3.2 耐热基因的克隆 | 第68-70页 |
| 2.3.3 耐热元器件的组装 | 第70-71页 |
| 2.3.4 单功能耐热元器件重组质粒的提取与验证 | 第71-72页 |
| 2.3.5 单功能酿酒酵母工程菌的构建与验证 | 第72-74页 |
| 2.3.6 耐热基因转录水平考察 | 第74-75页 |
| 2.3.7 耐热基因表征与分析 | 第75-76页 |
| 2.4 小结 | 第76-77页 |
| 第三章 耐热酿酒酵母工程菌的特性分析 | 第77-93页 |
| 引言 | 第77页 |
| 3.1 材料 | 第77-79页 |
| 3.1.1 菌株 | 第77-78页 |
| 3.1.2 药品与试剂 | 第78页 |
| 3.1.3 仪器设备 | 第78页 |
| 3.1.4 培养基 | 第78-79页 |
| 3.1.5 主要溶液 | 第79页 |
| 3.2 方法 | 第79-83页 |
| 3.2.1 菌株活化 | 第79页 |
| 3.2.2 耐热工程菌梯度升温培养 | 第79页 |
| 3.2.3 耐热工程菌恒定高温培养 | 第79页 |
| 3.2.4 耐热工程菌的细胞存活率测定 | 第79页 |
| 3.2.5 耐热工程菌的刚果红敏感性考察 | 第79-80页 |
| 3.2.6 耐热工程菌的海藻糖含量测定 | 第80-81页 |
| 3.2.7 酿酒酵母总RNA的提取与反转录 | 第81页 |
| 3.2.8 qRT-PCR | 第81页 |
| 3.2.9 耐热工程菌胞内活性氧自由基含量的测定 | 第81页 |
| 3.2.10耐热工程菌的乙醇耐受性考察 | 第81-82页 |
| 3.2.11耐热酿酒酵母底盘宿主的构建 | 第82-83页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第83-92页 |
| 3.3.1 耐热工程菌恒定高温发酵 | 第83-84页 |
| 3.3.2 耐热工程菌的细胞存活率表征 | 第84-85页 |
| 3.3.3 耐热工程菌的刚果红敏感性 | 第85-86页 |
| 3.3.4 耐热工程菌细胞壁相关合成基因的转录水平 | 第86-87页 |
| 3.3.5 耐热工程菌胞内的海藻糖含量变化 | 第87页 |
| 3.3.6 丙酮酸激酶cdc19基因的转录水平 | 第87-88页 |
| 3.3.7 耐热工程菌胞内的ROS水平 | 第88-89页 |
| 3.3.8 耐热工程菌的乙醇耐受性 | 第89-90页 |
| 3.3.9 耐热底盘宿主的耐热性能 | 第90-92页 |
| 3.4 小结 | 第92-93页 |
| 第四章 耐热元器件优化与酿酒酵母的适配性 | 第93-109页 |
| 引言 | 第93页 |
| 4.1 材料 | 第93-94页 |
| 4.1.1 菌株与质粒 | 第93页 |
| 4.1.2 药品与试剂 | 第93页 |
| 4.1.3 仪器设备 | 第93-94页 |
| 4.1.4 培养基 | 第94页 |
| 4.1.5 主要溶液 | 第94页 |
| 4.2 方法 | 第94-100页 |
| 4.2.1 菌株活化 | 第94页 |
| 4.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及热激转化 | 第94页 |
| 4.2.3 耐热元器件的重新设计与组装 | 第94-97页 |
| 4.2.4 单功能耐热元器件重组质粒的重新构建 | 第97页 |
| 4.2.5 大肠杆菌重组质粒的提取 | 第97页 |
| 4.2.6 酿酒酵母感受态细胞的制备及电击转化 | 第97页 |
| 4.2.7 单功能耐热酿酒酵母工程菌的重新构建 | 第97页 |
| 4.2.8 酿酒酵母重组质粒的提取 | 第97页 |
| 4.2.9 单功能耐热酿酒酵母工程菌发酵 | 第97页 |
| 4.2.10 qRT-PCR | 第97-98页 |
| 4.2.11单功能耐热元器件终止子的更换 | 第98页 |
| 4.2.12双功能耐热元器件及工程菌的构建 | 第98-100页 |
| 4.2.13双功能耐热工程菌恒定高温发酵 | 第100页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第100-108页 |
| 4.3.1 启动子的选择 | 第100页 |
| 4.3.2 启动子及耐热基因的克隆 | 第100-101页 |
| 4.3.3 单功能耐热元器件重组质粒的提取与验证 | 第101-102页 |
| 4.3.4 单功能耐热工程菌的构建与验证 | 第102-103页 |
| 4.3.5 耐热工程菌的耐热性表征 | 第103-105页 |
| 4.3.6 单功能耐热元器件终止子的克隆 | 第105页 |
| 4.3.7 双功能耐热元器件基因的克隆 | 第105-106页 |
| 4.3.8 双功能耐热工程菌的构建与验证 | 第106-107页 |
| 4.3.9 双功能耐热工程菌的耐热性表征 | 第107-108页 |
| 4.4 小结 | 第108-109页 |
| 第五章 耐热酿酒酵母的功能验证及应用 | 第109-125页 |
| 引言 | 第109-110页 |
| 5.1 材料 | 第110-112页 |
| 5.1.1 菌株与质粒 | 第110页 |
| 5.1.2 仪器设备 | 第110页 |
| 5.1.3 药品与试剂 | 第110-111页 |
| 5.1.4 培养基 | 第111页 |
| 5.1.5 主要溶液 | 第111-112页 |
| 5.2 方法 | 第112-115页 |
| 5.2.1 菌株活化 | 第112页 |
| 5.2.2 酿酒酵母感受态细胞的制备及电击转化 | 第112页 |
| 5.2.3 耐热β-香树脂醇工程菌及耐热乙醇酵母工程菌的构建 | 第112页 |
| 5.2.4 酿酒酵母重组质粒的提取 | 第112页 |
| 5.2.5 β-香树脂醇酿酒酵母工程菌高温发酵 | 第112-113页 |
| 5.2.6 β-香树脂醇的提取 | 第113页 |
| 5.2.7 β-香树脂醇的GC检测 | 第113-114页 |
| 5.2.8 耐热酿酒酵母工程菌高温乙醇发酵 | 第114页 |
| 5.2.9 耐热乙醇酵母合成培养基发酵 | 第114-115页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第115-124页 |
| 5.3.1 耐热β-香树脂醇工程菌的构建与验证 | 第115页 |
| 5.3.2 耐热β-香树脂醇工程菌梯度升温发酵 | 第115-117页 |
| 5.3.3 耐热β-香树脂醇工程菌恒定高温发酵 | 第117-118页 |
| 5.3.4 耐热β-香树脂醇工程菌 35℃，38℃发酵 | 第118-120页 |
| 5.3.5 耐热酿酒酵母工程菌 42℃乙醇发酵 | 第120-121页 |
| 5.3.6 耐热乙醇酵母工程菌的构建与验证 | 第121-122页 |
| 5.3.7 耐热乙醇酵母工程菌 35℃乙醇发酵 | 第122-124页 |
| 5.4 小结 | 第124-125页 |
| 第六章 结论与展望 | 第125-128页 |
| 6.1 结论及创新点 | 第125-126页 |
| 6.2 展望 | 第126-128页 |
| 参考文献 | 第128-140页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第140-141页 |
| 致谢 | 第141-142页 |
