| 摘要 | 第3-4页 |
| ABSTRACT | 第4-5页 |
| 中英文缩略表 | 第9-11页 |
| 前言 | 第11-14页 |
| 第1章 Hep3B 细胞的 cDNA 文库及诱饵质粒的构建 | 第14-50页 |
| 材料与方法 | 第14-43页 |
| 1 材料 | 第14-18页 |
| 1.1 实验材料 | 第14页 |
| 1.2 试剂 | 第14-15页 |
| 1.3 自配试剂 | 第15-17页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第17-18页 |
| 2 细胞培养 | 第18-19页 |
| 2.1 细胞复苏 | 第18-19页 |
| 2.2 细胞传代 | 第19页 |
| 2.3 细胞冻存 | 第19页 |
| 3. RNA 的提取 | 第19-21页 |
| 3.1 总 RNA 提取 | 第19-20页 |
| 3.2 高纯度 Poly(A)+ mRNA 提取 | 第20-21页 |
| 4.Hep3B 细胞 cDNA 文库的构建 | 第21-27页 |
| 4.1 1st Strand cDNA 的合成 | 第21-22页 |
| 4.2 2nd Strand cDNA 的合成 | 第22-23页 |
| 4.3 Adaptor Ligation | 第23页 |
| 4.4 限制酶 EcoRI 酶切反应 | 第23页 |
| 4.5 使用 Spin Column 除去短链 cDNA | 第23-24页 |
| 4.6 Vector Ligation | 第24页 |
| 4.7 质粒电转化 | 第24-26页 |
| 4.8 文库质量鉴定 | 第26-27页 |
| 5.诱饵质粒 pGBKT7-FAT10 的构建 | 第27-36页 |
| 5.1 质粒构建流程 | 第27-30页 |
| 5.2 Hep3B 细胞总 RNA 提取 | 第30页 |
| 5.3 RNA 逆转录成 cDNA | 第30页 |
| 5.4 PCR 扩增 | 第30-31页 |
| 5.5 高效感受态的转化 | 第31-32页 |
| 5.6 质粒的提取(SDS 碱裂解法小量提取法) | 第32-33页 |
| 5.7 质粒的酶切鉴定 | 第33页 |
| 5.8 切胶回收,纯化 DNA | 第33-34页 |
| 5.9 定向连接 | 第34页 |
| 5.10 重组质粒的提取和粗略鉴定 | 第34-35页 |
| 5.11 转染用无内毒素质粒的提取 | 第35-36页 |
| 5.12 核酸定量分析仪测质粒 DNA 浓度 | 第36页 |
| 6. 重组质粒的测序鉴定 | 第36-39页 |
| 6.1 质粒的提取 | 第36-37页 |
| 6.2 引物设计合成： | 第37页 |
| 6.3 PCR 反应体系及扩增条件 | 第37页 |
| 6.4 PCR 产物纯化及序列测定 | 第37-39页 |
| 7.pcDNA5/FAT10 重组质粒 FAT10 蛋白表达情况的检测 | 第39-42页 |
| 7.1 质粒转染 | 第39-40页 |
| 7.2 细胞蛋白提取 | 第40页 |
| 7.3 Western blot 操作流程 | 第40-42页 |
| 7.3.1 SDS－PAGE 电泳 | 第40-41页 |
| 7.3.2 转膜 | 第41页 |
| 7.3.3 免疫反应 | 第41页 |
| 7.3.4 化学发光，显影，定影 | 第41-42页 |
| 7.3.5 凝胶图象分析 | 第42页 |
| 8.统计学分析 | 第42-43页 |
| 结果 | 第43-48页 |
| 1.Hep3B 细胞 cDNA 文库的构建 | 第43-45页 |
| 1.1 总 RNA 和 mRNA 提取结果分析 | 第43页 |
| 1.2 cDNA 合成质量鉴定结果 | 第43-45页 |
| 2 诱饵质粒 pGBKT7-FAT10 的构建 | 第45-48页 |
| 讨论 | 第48-49页 |
| 结论 | 第49-50页 |
| 第2章 酵母双杂交系统筛选类泛素蛋白FAT10 的相互作用蛋白 | 第50-66页 |
| 材料与方法 | 第50-59页 |
| 1 材料 | 第50-52页 |
| 1.1 实验材料 | 第50页 |
| 1.2 自配试剂 | 第50-51页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第51-52页 |
| 2 酵母双杂交筛选 | 第52-59页 |
| 2.1 制备酵母感受态细胞 | 第52页 |
| 2.2 pGBKT7-FAT10 质粒转化入 AH109 酵母感受态细胞 | 第52-53页 |
| 2.3 β-半乳糖苷酶活性的定性检测 | 第53页 |
| 2.4 FAT10 蛋白自身激活报道基因的活性检测 | 第53-54页 |
| 2.5 文库质粒大规模转化已携带“诱饵”质粒的酵母 | 第54-56页 |
| 2.6 转化子的筛选与库质粒纯化 | 第56页 |
| 2.7 酵母质粒 DNA 的提取 | 第56-57页 |
| 2.8 回交实验确证检测及作用蛋白的确定 | 第57-58页 |
| 2.9 测序 | 第58-59页 |
| 结果 | 第59-63页 |
| 讨论 | 第63-65页 |
| 结论 | 第65-66页 |
| 第3章 FAT10 蛋白和 eEF1A1 蛋白相互作用确定及调节研究 | 第66-83页 |
| 材料与方法 | 第66-75页 |
| 1 材料 | 第66-70页 |
| 1.1 实验材料 | 第66页 |
| 1.2 试剂 | 第66页 |
| 1.3 自配试剂 | 第66-69页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第69-70页 |
| 2 细胞培养 | 第70-71页 |
| 2.1 细胞复苏 | 第70页 |
| 2.2 细胞传代 | 第70-71页 |
| 2.3 细胞冻存 | 第71页 |
| 3 免疫共沉淀检测 | 第71-72页 |
| 4 激光共聚焦免疫荧光检测 | 第72页 |
| 5 .FAT10 干扰片段瞬时转染 Hep3B 细胞 | 第72-73页 |
| 6 siRNA 转染后实时荧光定量 PCR 对 FAT10 和 eEF1A1 mRNA 的检测 | 第73-74页 |
| 6.1 RNA 的提取、逆转录及引物 | 第73-74页 |
| 6.2 实时荧光定量 PCR 扩增 | 第74页 |
| 7 siRNA 转染后 Western blot 对 FAT10 和 eEF1A1 蛋白的检测 | 第74页 |
| 7.1 细胞蛋白提取 | 第74页 |
| 7.2 Western blot 检测 FAT10 和 eEF1A1 蛋白的表达 | 第74页 |
| 8.统计学分析 | 第74-75页 |
| 结果 | 第75-79页 |
| 讨论 | 第79-82页 |
| 结论 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-87页 |
| 综述 | 第87-96页 |
| 参考文献 | 第93-96页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第96页 |
