| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一节 绪论 | 第9-18页 |
| 一、树鼩 | 第9-13页 |
| 1. 树鼩的分类地位 | 第9-11页 |
| 2. 树鼩原代肝细胞模型在嗜肝病毒研究中的应用 | 第11-13页 |
| 二、肝细胞的永生化策略 | 第13-16页 |
| 三、本课题的研究目的和意义 | 第16-18页 |
| 第二节 树鼩原代肝细胞的分离、培养和鉴定 | 第18-44页 |
| 一、实验材料 | 第18-21页 |
| 1. 实验动物 | 第18页 |
| 2. 细胞株 | 第18页 |
| 3. 主要试剂 | 第18-19页 |
| 4. 主要耗材 | 第19页 |
| 5. 主要仪器设备 | 第19-20页 |
| 6. 灌注用实验器材准备 | 第20-21页 |
| 二、实验方法 | 第21-33页 |
| 1. 树鼩的麻醉 | 第21页 |
| 2. 树鼩的固定 | 第21页 |
| 3. 从股静脉处注射肝素,进行抗凝处理 | 第21页 |
| 4. 两步灌注法获取树鼩原代肝细胞 | 第21-25页 |
| 5. 主要溶液的配制 | 第25-27页 |
| 6. 台盼蓝染色计算肝细胞存活率 | 第27页 |
| 7. 树鼩原代肝细胞(Primary tupaia hepatacyte,PTH)形态学观察 | 第27-28页 |
| 8. 树鼩原代肝细胞的传代、冻存和复苏试验 | 第28页 |
| 9. 对分离获得的细胞进行PAS(Periodic Acid-Schiff stain)染色鉴定 | 第28-29页 |
| 10. 对分离出的细胞进行油红O染色鉴定 | 第29-30页 |
| 11. 间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence,IFA)检测PTH6的SV40TAg和Alb表达 | 第30页 |
| 12. Western Blot检测PTH6中SV40TAg、Alb的表达 | 第30-33页 |
| 三、实验结果与分析 | 第33-40页 |
| 1. 树鼩原代肝细胞的产量及细胞存活率 | 第33页 |
| 2. 树鼩原代肝细胞的形态学特征 | 第33-35页 |
| 3. 树鼩原代肝细胞不易传代、冻存和复苏 | 第35-36页 |
| 4. 树鼩原代肝细胞的功能鉴定 | 第36-40页 |
| 四、讨论 | 第40-43页 |
| 五、小结 | 第43-44页 |
| 第三节 永生化树鼩肝细胞系ITH6.1的建立和特性分析 | 第44-85页 |
| 一. 实验材料 | 第44-47页 |
| 1. 病毒 | 第44页 |
| 2. 细胞系 | 第44-45页 |
| 3. 质粒与载体 | 第45页 |
| 4. 抗体 | 第45页 |
| 5. 试剂盒 | 第45页 |
| 6. 主要试剂 | 第45-46页 |
| 7. 实验耗材 | 第46-47页 |
| 8. 仪器设备 | 第47页 |
| 二、实验方法 | 第47-59页 |
| 1. 携目的基因的慢病毒载体的包装 | 第47页 |
| 2. 含SV40TAg基因重组慢病毒感染树鼩原代肝细胞 | 第47-48页 |
| 3. ITH6细胞的传代、冻存和复苏 | 第48页 |
| 4. 有限稀释法挑选单克隆细胞株 | 第48-49页 |
| 5. ITH6.1细胞形态学观察 | 第49页 |
| 6. ITH6.1的PAS染色鉴定 | 第49页 |
| 7. ITH6.1油红O染色鉴定 | 第49页 |
| 8. 间接免疫荧光法(IFA)检测ITH6.1的SV40TAg和Alb表达 | 第49页 |
| 9. Western blot检测ITH6.1的SV40TAg、Alb表达 | 第49-50页 |
| 10. ITH6.1肝细胞细胞功能基因的RT-PCR分析 | 第50-53页 |
| 11. ITH6.1的生长曲线的绘制(计数法) | 第53页 |
| 12. ITH6.1培养上清白蛋白、尿素氮、转氨酶测定 | 第53页 |
| 13. ITH6.1种属来源鉴定实验 | 第53页 |
| 14. PTH6和ITH6.1的STR分型 | 第53-55页 |
| 15. ITH6.1染色体核型分析 | 第55-56页 |
| 16. 实时定量PCR方法测定不同代次ITH6.1的T/S值 | 第56-57页 |
| 17. ITH6.1的病毒易感性实验 | 第57-59页 |
| 18.主要洛液配制 | 第59页 |
| 三.实验结果与分析 | 第59-77页 |
| 1. PTH6经慢病毒感染后的传代、冻存后复苏 | 第59-61页 |
| 2. 通过有限稀释法筛选获得ITH6的亚克隆细胞株：ITH6.1 | 第61-62页 |
| 3. 永生化树鼩肝细胞ITH6.1的形态特征 | 第62-63页 |
| 4. 永生化树鼩肝细胞ITH6.1中可以检测到SV40TAg的表达 | 第63-64页 |
| 5. ITH6.1中检测到肝细胞特异功能蛋白白蛋白的表达 | 第64-66页 |
| 6. ITH6.1的PAS染色鉴定 | 第66页 |
| 7. ITH6.1的油红O染色鉴定 | 第66-67页 |
| 8. ITH6.1细胞的RT-PCR检测 | 第67-68页 |
| 9. ITH6.1的细胞生长曲线(计数法) | 第68页 |
| 10. ITH6.1细胞培养上清液白蛋白、尿素氮、转氨酶的测定 | 第68-69页 |
| 11. ITH6.1细胞的种属鉴定 | 第69-71页 |
| 12. PTH6与ITH6.1在中国树鼩的8个STR位点上的基因分型结果相同 | 第71-72页 |
| 13. ITH6.1染色体分析 | 第72-73页 |
| 14. ITH6.1端粒相对长度随着细胞传代次数增加逐渐缩短 | 第73-74页 |
| 15. ITH6.1的病毒易感性研究 | 第74-77页 |
| 四. 讨论 | 第77-82页 |
| 五. 小结 | 第82-85页 |
| 第四节 永生化树鼩肝细胞系ITH6.1的安全性研究 | 第85-102页 |
| 一. 实验材料 | 第85-86页 |
| 1. 实验动物 | 第85页 |
| 2. 细胞系 | 第85-86页 |
| 3. 细胞培养基 | 第86页 |
| 4. 实验耗材 | 第86页 |
| 二. 实验方法 | 第86-91页 |
| 1. 细胞接种裸鼠前的存活率测定 | 第86页 |
| 2. 裸鼠致瘤实验 | 第86-89页 |
| 3. ITH6.1对阿昔洛维的敏感性实验 | 第89页 |
| 4. ITH6.1的回复性实验 | 第89-91页 |
| 三. 实验结果与分析 | 第91-98页 |
| 1. ITH6.1不会使裸鼠成瘤 | 第91-94页 |
| 2. ITH6.1对阿昔洛韦敏感 | 第94-95页 |
| 3. ITH6.1被EGFP-Cre-Ad感染后SV40TAg的表达逐渐降低 | 第95-98页 |
| 四. 讨论 | 第98-101页 |
| 五. 小结 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-105页 |
| 附录Ⅰ 主要缩略词表 | 第105-106页 |
| 附录Ⅱ 常用溶液配方 | 第106-110页 |
| 致谢 | 第110-111页 |
| 研究生简历 | 第111页 |
| 已发表文章 | 第111-112页 |
| 博士期间待发表SCI文章 | 第112-113页 |
