| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 1 引言 | 第13-20页 |
| 1.1 DEK蛋白 | 第13-14页 |
| 1.2 DEK作为肿瘤生物标志物的发展潜能 | 第14-15页 |
| 1.3 DEK与肺癌的关系 | 第15页 |
| 1.4 启动子区域甲基化水平与转录的起始 | 第15-17页 |
| 1.5 研究的意义 | 第17页 |
| 1.6 研究目的和内容 | 第17-19页 |
| 1.6.1 研究目的 | 第17页 |
| 1.6.2 研究内容 | 第17-19页 |
| 1.6.2.1 DEK在肺肿瘤组织中表达水平的检测 | 第17-18页 |
| 1.6.2.2 A549肺癌细胞系DEK基因的沉默与过表达 | 第18页 |
| 1.6.2.3 DEK表达水平的改变对A549肺癌细胞系细胞功能的影响 | 第18页 |
| 1.6.2.4 DEK表达水平改变对相关基因表达水平的影响 | 第18页 |
| 1.6.2.5 DEK启动子区域甲基化水平的检测 | 第18-19页 |
| 1.7 技术路线 | 第19-20页 |
| 2 实验材料 | 第20-24页 |
| 2.1 临床样本 | 第20页 |
| 2.2 细胞培养相关材料 | 第20页 |
| 2.1.1 细胞株 | 第20页 |
| 2.1.2 细胞培养主要试剂 | 第20页 |
| 2.3 细菌培养相关材料 | 第20-21页 |
| 2.3.1 细菌菌株 | 第20-21页 |
| 2.3.2 细菌培养所用主要试剂 | 第21页 |
| 2.4 质粒、siRNA与引物 | 第21-23页 |
| 2.5 试剂与试剂盒 | 第23-24页 |
| 3 实验方法 | 第24-39页 |
| 3.1 组织RNA的提取与RT-PCR | 第24-26页 |
| 3.1.1 TRIzol提取组织RNA | 第24页 |
| 3.1.2 RT-PCR合成cDNA第一链 | 第24-25页 |
| 3.1.3 半定量RT-PCR | 第25页 |
| 3.1.4 实时荧光定量RT-PCR | 第25-26页 |
| 3.2 石蜡切片免疫组化 | 第26-27页 |
| 3.3 肺癌细胞系的复苏、培养与冻存 | 第27-29页 |
| 3.3.1 肺癌细胞系的复苏 | 第27页 |
| 3.3.2 肺癌细胞系的培养 | 第27-28页 |
| 3.3.3 肺癌细胞系的冻存 | 第28页 |
| 3.3.4 细胞系RNA的提取 | 第28-29页 |
| 3.4 蛋白表达水平的检测——Western Blotting | 第29-32页 |
| 3.4.1 使用抗体、稀释比例及蛋白分子量大小 | 第29页 |
| 3.4.2 贴壁培养细胞的收集与裂解 | 第29-30页 |
| 3.4.3 SDS-PAGE凝胶配制 | 第30页 |
| 3.4.4 SDS-PAGE电泳 | 第30-31页 |
| 3.4.5 免疫印迹操作——转膜(半干法) | 第31页 |
| 3.4.6 免疫检测 | 第31页 |
| 3.4.7 显影曝光 | 第31-32页 |
| 3.5 质粒的转化与提取 | 第32-34页 |
| 3.5.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第32页 |
| 3.5.2 质粒的转化 | 第32页 |
| 3.5.3 质粒的提取 | 第32-33页 |
| 3.5.4 双酶切鉴定pcDNA3.1-hDEK、pcDNA3.1-EGFP质粒 | 第33页 |
| 3.5.5 提取高纯度转染级质粒 | 第33-34页 |
| 3.6 A549细胞系的转染 | 第34-35页 |
| 3.7 MTT细胞增殖检测试验 | 第35页 |
| 3.8 集落形成检测实验 | 第35页 |
| 3.9 Annexin V-PE细胞凋亡检测实验 | 第35页 |
| 3.10 Matrigel细胞侵袭检测试验 | 第35-36页 |
| 3.11 DEK基因启动子区域甲基化水平的检测——硫化测序PCR(BSP) | 第36-38页 |
| 3.11.1 组织基因组DNA的提取 | 第36页 |
| 3.11.2 硫化处理修饰基因组DNA | 第36-37页 |
| 3.11.3 硫化处理修饰后的DNA扩增 | 第37页 |
| 3.11.4 胶回收纯化PCR反应产物 | 第37-38页 |
| 3.11.5 T载体连接 | 第38页 |
| 3.12 统计分析 | 第38-39页 |
| 4 实验结果 | 第39-68页 |
| 4.1 DEK在肺肿瘤组织中表达水平的检测 | 第39-48页 |
| 4.1.1 半定量RT-PCR检测肺肿瘤组织中DEK mRNA的差异表达 | 第39-41页 |
| 4.1.2 实时荧光定量RT-PCR检测肺肿瘤组织中DEK mRNA的差异表达 | 第41-43页 |
| 4.1.3 免疫组化实验检测肺肿瘤组织中DEK蛋白的差异表达 | 第43-45页 |
| 4.1.4 实时荧光定量RT-PCR及免疫组化实验结果统计 | 第45-48页 |
| 4.2 A549肺癌细胞系DEK基因的沉默与过表达 | 第48-54页 |
| 4.2.1 DEK在肺癌细胞系中的表达水平检测 | 第48-49页 |
| 4.2.2 载体的鉴定 | 第49-50页 |
| 4.2.3 实时荧光定量RT-PCR筛选DEK基因沉默效果最佳的siRNA | 第50-51页 |
| 4.2.4 实时荧光定量RT-PCR确定实验使用siRNA-3沉默DEK基因的最佳转染时间 | 第51-52页 |
| 4.2.5 实时荧光定量RT-PCR检测转染DEK沉默siRNA与DEK过表达质粒后DEK mRNA表达量 | 第52-53页 |
| 4.2.6 Western Blotting检测转染DEK沉默siRNA与DEK过表达质粒后DEK蛋白表达量 | 第53-54页 |
| 4.3 DEK表达水平的改变对A549肺癌细胞系细胞功能的影响 | 第54-61页 |
| 4.3.1 MTT法检测DEK表达水平改变对细胞增殖能力的影响 | 第54-56页 |
| 4.3.2 集落形成实验检测DEK表达水平改变对细胞增殖能力的影响 | 第56-58页 |
| 4.3.3 Annexin V-PE检测DEK表达水平改变对细胞凋亡的影响 | 第58-59页 |
| 4.3.4 Matrigel细胞侵袭实验检测DEK表达水平改变对细胞侵袭能力的影响 | 第59-61页 |
| 4.4 DEK表达水平改变对相关基因表达水平的影响 | 第61-64页 |
| 4.4.1 实时荧光定量RT-PCR检测DEK表达水平改变对p53、p65、ATMmRNA表达水平的影响 | 第61-63页 |
| 4.4.2 Western Blotting检测DEK表达水平改变对p53、p65、ATM蛋白表达水平的影响 | 第63-64页 |
| 4.5 DEK启动子区域甲基化水平的检测 | 第64-68页 |
| 5 讨论 | 第68-76页 |
| 5.1 DEK在肺肿瘤组织中表达水平的检测 | 第68-71页 |
| 5.2 DEK表达水平与肺癌细胞功能之间的关系 | 第71-72页 |
| 5.3 DEK表达水平与相关基因表达水平之间的关系 | 第72-74页 |
| 5.4 DEK启动子区域甲基化水平的检测 | 第74-76页 |
| 6 结论 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-80页 |
| 附录A | 第80-82页 |
| 附录B | 第82-84页 |
| 附录C | 第84-85页 |
| 作者简历及攻读硕士/博士学位期间取得的研究成果 | 第85-87页 |
| 学位论文数据集 | 第87页 |
