| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 序言 | 第12-22页 |
| 1.1 谷氨酰胺转胺酶(MTG)概述 | 第12-16页 |
| 1.1.1 谷氨酰胺转胺酶 | 第12-13页 |
| 1.1.2 谷氨酰胺转胺酶的功能 | 第13-14页 |
| 1.1.3 谷氨酰胺转胺酶的应用 | 第14-16页 |
| 1.2 谷氨酰胺转胺酶的异源表达研究 | 第16-17页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 | 第17-20页 |
| 1.5 本研究目的和意义 | 第20-21页 |
| 1.6 本研究技术路线 | 第21-22页 |
| 第二章 谷氨酰胺转胺酶基因的克隆、表达载体构建、在毕赤酵母中的活性表达及发酵条件优化 | 第22-58页 |
| 2.1 材料与方法 | 第22-39页 |
| 2.1.1 材料 | 第22-26页 |
| 2.1.1.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.1.1.2 培养基 | 第22-23页 |
| 2.1.1.3 分子生物学常用酶和试剂盒 | 第23-24页 |
| 2.1.1.4 常用试剂、缓冲液和仪器 | 第24-26页 |
| 2.1.2 方法 | 第26-39页 |
| 2.1.2.1 茂原链霉菌基因组的提取 | 第26-27页 |
| 2.1.2.2 引物设计 | 第27页 |
| 2.1.2.3 谷胺酰转氨酶基因和酶原序列的克隆 | 第27-29页 |
| 2.1.2.4 载体质粒提取 | 第29-30页 |
| 2.1.2.5 目的基因、酶原序列和载体的双酶切 | 第30页 |
| 2.1.2.6 目的基因与酶原序列表达载体构建 | 第30-31页 |
| 2.1.2.7 目的基因与酶原序列共表达载体构建 | 第31-32页 |
| 2.1.2.8 多拷贝目的基因与酶原序列共表达载体构建 | 第32-33页 |
| 2.1.2.9 重组质粒载体线性化 | 第33页 |
| 2.1.2.10 毕赤酵母感受态的制备 | 第33-34页 |
| 2.1.2.11 重组质粒载体电转化毕赤酵母 | 第34-35页 |
| 2.1.2.12 毕赤酵母基因组提取 | 第35页 |
| 2.1.2.13 重组菌株筛选 | 第35-36页 |
| 2.1.2.14 含有不同基因共表达盒拷贝数的重组菌株摇瓶发酵 | 第36页 |
| 2.1.2.15 摇瓶发酵产物酶活力测定 | 第36-37页 |
| 2.1.2.16 最优拷贝数重组菌株摇瓶发酵pH优化 | 第37页 |
| 2.1.2.17 最优拷贝数重组菌株摇瓶发酵培养基优化 | 第37页 |
| 2.1.2.18 高密度发酵 | 第37-39页 |
| 2.2 结果与分析 | 第39-57页 |
| 2.2.1 茂原链霉菌基因组的提取 | 第39页 |
| 2.2.2 谷胺酰转氨酶基因和酶原序列的克隆 | 第39-40页 |
| 2.2.3 载体质粒提取 | 第40页 |
| 2.2.4 目的基因与酶原序列表达载体构建及鉴定 | 第40-44页 |
| 2.2.4.1 菌落PCR鉴定 | 第43页 |
| 2.2.4.2 酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 2.2.4.3 测序分析 | 第44页 |
| 2.2.5 目的基因与酶原序列共表达载体构建及鉴定 | 第44-46页 |
| 2.2.5.1 菌落PCR鉴定 | 第44-46页 |
| 2.2.5.2 酶切鉴定 | 第46页 |
| 2.2.6 多拷贝目的基因与酶原序列共表达载体构建及鉴定 | 第46-48页 |
| 2.2.7 重组质粒载体线性化 | 第48-49页 |
| 2.2.8 重组菌株筛选 | 第49-51页 |
| 2.2.8.1 菌落PCR鉴定 | 第49-50页 |
| 2.2.8.2 Real-Time PCR鉴定 | 第50-51页 |
| 2.2.9 含有不同基因共表达盒拷贝数的重组菌株摇瓶发酵及酶活力测定 | 第51-53页 |
| 2.2.9.1 不同重组菌株摇瓶发酵OD_(600nm)值变化 | 第51页 |
| 2.2.9.2 谷氨酰胺转胺酶酶活力测定标准曲线 | 第51-52页 |
| 2.2.9.3 不同重组菌株摇瓶发酵96 h酶活力测定 | 第52-53页 |
| 2.2.9.4 不同重组菌株摇瓶发酵96 h发酵液SDS-PAGE分析 | 第53页 |
| 2.2.10 最优拷贝数重组菌株GS2MTG摇瓶发酵pH优化 | 第53-54页 |
| 2.2.11 最优拷贝数重组菌株GS2MTG摇瓶发酵培养基优化 | 第54-55页 |
| 2.2.12 高密度发酵 | 第55-57页 |
| 2.3 本章小结 | 第57-58页 |
| 第三章 蛋白伴侣库的建立 | 第58-72页 |
| 3.1 材料与方法 | 第58-65页 |
| 3.1.1 材料 | 第58-60页 |
| 3.1.1.1 蛋白伴侣一览表 | 第58-59页 |
| 3.1.1.2 菌株和质粒 | 第59-60页 |
| 3.1.1.3 培养基 | 第60页 |
| 3.1.1.4 分子生物学常用酶和试剂盒 | 第60页 |
| 3.1.1.5 常用试剂、缓冲液和仪器 | 第60页 |
| 3.1.2 方法 | 第60-65页 |
| 3.1.2.1 毕赤酵母GS115基因组的提取 | 第60-61页 |
| 3.1.2.2 引物设计 | 第61-62页 |
| 3.1.2.3 蛋白伴侣基因的克隆 | 第62页 |
| 3.1.2.4 载体质粒提取 | 第62-63页 |
| 3.1.2.5 载体双酶切 | 第63页 |
| 3.1.2.6 蛋白伴侣表达载体构建 | 第63-65页 |
| 3.2 结果与分析 | 第65-71页 |
| 3.2.1 毕赤酵母基因组提取 | 第65页 |
| 3.2.2 系列蛋白伴侣基因的克隆 | 第65-66页 |
| 3.2.3 载体质粒提取 | 第66页 |
| 3.2.4 系列蛋白伴侣表达载体构建及鉴定 | 第66-71页 |
| 3.2.4.1 菌落PCR鉴定 | 第67-68页 |
| 3.2.4.2 酶切鉴定 | 第68-69页 |
| 3.2.4.3 序列分析 | 第69-71页 |
| 3.3 本章小结 | 第71-72页 |
| 第四章 蛋白伴侣对毕赤酵母表达谷氨酰胺转胺酶的影响 | 第72-80页 |
| 4.1 材料与方法 | 第72-76页 |
| 4.1.1 材料 | 第72-74页 |
| 4.1.1.1 菌株和质粒 | 第72-73页 |
| 4.1.1.2 培养基 | 第73页 |
| 4.1.1.3 分子生物学常用酶和试剂盒 | 第73-74页 |
| 4.1.1.4 常用试剂、缓冲液和仪器 | 第74页 |
| 4.1.2 方法 | 第74-76页 |
| 4.1.2.1 系列蛋白伴侣质粒载体线性化 | 第74页 |
| 4.1.2.2 系列蛋白伴侣与谷氨酰胺转胺酶共表达菌株筛选 | 第74页 |
| 4.1.2.3 系列蛋白伴侣与谷氨酰胺转胺酶共表达菌株摇瓶发酵及酶活测定 | 第74-76页 |
| 4.2 结果与分析 | 第76-79页 |
| 4.2.1 系列蛋白伴侣质粒载体线性化 | 第76页 |
| 4.2.2 系列蛋白伴侣与谷氨酰胺转胺酶共表达菌株筛选 | 第76-77页 |
| 4.2.3 系列蛋白伴侣与谷氨酰胺转胺酶共表达菌株摇瓶发酵及酶活力测定 | 第77-79页 |
| 4.2.3.1 共表达菌株摇瓶发酵OD600nm值变化 | 第77-78页 |
| 4.2.3.2 共表达菌株摇瓶发酵96h蛋白表达水平 | 第78页 |
| 4.2.3.3 共表达菌株摇瓶发酵96h酶活力测定 | 第78-79页 |
| 4.3 本章小结 | 第79-80页 |
| 第五章 讨论 | 第80-82页 |
| 5.1 谷氨酰胺转胺酶(MTG)的表达策略 | 第80页 |
| 5.2 毕赤酵母表达谷氨酰胺转胺酶(MTG)的发酵条件 | 第80页 |
| 5.3 毕赤酵母分泌途径的改造 | 第80-81页 |
| 5.4 蛋白伴侣C467 | 第81页 |
| 5.5 谷氨酰胺转胺酶的工业化生产和展望 | 第81-82页 |
| 第六章 结论 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-91页 |
| 附录一 文中拉丁文名称和缩写说明 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-94页 |
| 在读期间发表的学术论文及其它成果 | 第94页 |
