| 中文摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第11-25页 |
| ·关于纤维素酶的研究 | 第11-20页 |
| ·纤维素和纤维素酶的概况 | 第11页 |
| ·纤维素酶降解天然纤维素的机理 | 第11-12页 |
| ·纤维素酶的分子结构 | 第12-13页 |
| ·催化结构域 | 第12页 |
| ·纤维素结合(吸附)域 | 第12-13页 |
| ·连接桥 | 第13页 |
| ·纤维素酶的研究进展 | 第13-16页 |
| ·纤维素酶的应用与发展趋势 | 第16-17页 |
| ·纤维素酶的来源及酵母技术 | 第17-18页 |
| ·纤维素酶的分离纯化 | 第18-20页 |
| ·盐析法 | 第18页 |
| ·凝胶过滤 | 第18-19页 |
| ·亲和层析 | 第19页 |
| ·离子交换层析 | 第19页 |
| ·高效液相色谱(HPLC) | 第19-20页 |
| ·电泳 | 第20页 |
| ·产纤维素酶的微生物 | 第20页 |
| ·接头序列和融合基因的研究进展 | 第20-23页 |
| ·接头序列概况 | 第20-21页 |
| ·Linker的生物学特征 | 第21-22页 |
| ·Linker的设计方法 | 第22页 |
| ·理想Linker序列的设计 | 第22-23页 |
| ·Linker的组成 | 第22页 |
| ·Linker的长度 | 第22-23页 |
| ·Linker的整体折叠 | 第23页 |
| ·编码Linker的核苷酸组成 | 第23页 |
| ·Linker内部的氨基酸序列 | 第23页 |
| ·选题的目的意义、研究内容、技术路线 | 第23-25页 |
| ·选题的目的意义 | 第23页 |
| ·研究内容 | 第23-24页 |
| ·技术路线 | 第24-25页 |
| 2 材料和方法 | 第25-42页 |
| ·材料 | 第25-27页 |
| ·供试菌株 | 第25页 |
| ·菌株与质粒 | 第25页 |
| ·培养基 | 第25-26页 |
| ·主要仪器 | 第26页 |
| ·主要酶和试剂 | 第26页 |
| ·酵母表达贮存液配制 | 第26-27页 |
| ·DNS溶液的配制 | 第27页 |
| ·方法 | 第27-42页 |
| ·原始基因 61f和eg1以及cbh1的克隆 | 第27-33页 |
| ·引物设计 | 第27-28页 |
| ·总RNA的提取 | 第28-29页 |
| ·反转录 | 第29页 |
| ·基因 61f，eg1和cbh1的PCR扩增 | 第29页 |
| ·PCR产物回收 | 第29-30页 |
| ·连接载体 | 第30页 |
| ·制备大肠杆菌感受态细胞和转化 | 第30-31页 |
| ·筛选、鉴定重组质粒 | 第31-33页 |
| ·序列测定 | 第33页 |
| ·融合基因的构建 | 第33页 |
| ·eg1-61f和 61f-cbh1在毕赤酵母中的高效表达 | 第33-39页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第33-34页 |
| ·线性化酶切 | 第34-35页 |
| ·制备毕赤酵母 | 第35-36页 |
| ·筛选酵母转化体 | 第36-37页 |
| ·PCR鉴定酵母转化体 | 第37-39页 |
| ·酵母工程菌的培养和融合体的诱导分泌表达 | 第39页 |
| ·表达产物的生物活性检测 | 第39页 |
| ·工程菌表达产物的活性及酶学性质 | 第39-42页 |
| ·酶的纯化 | 第39-40页 |
| ·表达产物融合酶的SDS-PAGE分析 | 第40页 |
| ·融合体EG1-61F和 61F-CBH1的生物学特性 | 第40-42页 |
| 3 结果分析 | 第42-63页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种和嗜热毛壳菌的总RNA的提取 | 第42页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种 61f和eg1基因及嗜热毛壳菌cbh1基因成熟蛋白编码序列的克隆 | 第42-43页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种 61f和eg1基因以及嗜热毛壳菌cbh1基因序列测定 | 第43-45页 |
| ·融合体基因的构建 | 第45-46页 |
| ·融合体基因的核苷酸序列 | 第46-49页 |
| ·融合基因在毕赤酵母中的表达 | 第49-50页 |
| ·电击转化毕赤酵母和重组菌株的鉴定 | 第50-53页 |
| ·筛选酵母转化体的甲醇利用表型 | 第50-51页 |
| ·eg1-61f基因和 61f-cbh1基因多拷贝整合子的筛选 | 第51-52页 |
| ·酵母转化体的PCR鉴定 | 第52-53页 |
| ·表达产物的生物活性检测 | 第53页 |
| ·融合体的纯化 | 第53-54页 |
| ·糖苷水解酶 61F的纯化 | 第54-55页 |
| ·内切葡聚糖酶EG1的纯化 | 第55-56页 |
| ·外切葡聚糖酶CBH1的纯化 | 第56-57页 |
| ·融合体的的生物学特性 | 第57-63页 |
| ·最适反应温度 | 第57-58页 |
| ·最适反应pH值 | 第58-59页 |
| ·热稳定性 | 第59-60页 |
| ·底物特异性 | 第60-61页 |
| ·与单个酶单独表达时的酶活比较 | 第61-63页 |
| 4 讨论 | 第63-65页 |
| ·融合PCR反应程序 | 第63页 |
| ·关于融合蛋白的表达 | 第63-65页 |
| 5 结论与建议 | 第65-66页 |
| ·结论 | 第65页 |
| ·建议 | 第65-66页 |
| 展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
