| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-23页 |
| ·哈维氏弧菌的概况 | 第11-13页 |
| ·哈维弧菌的生物学特性 | 第11-12页 |
| ·哈维氏弧菌的流行病学 | 第12-13页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第13-17页 |
| ·毕赤酵母表达系统的操作流程 | 第13-14页 |
| ·菌株、载体、启动子 | 第14-15页 |
| ·外源基因的整合方式与拷贝数 | 第15-16页 |
| ·表达产物的糖基化 | 第16-17页 |
| ·外源基因的优化改造 | 第17页 |
| ·鱼用疫苗的研究进展 | 第17-22页 |
| ·传统疫苗 | 第17-18页 |
| ·新型疫苗 | 第18-22页 |
| ·本实验的目的与意义 | 第22-23页 |
| 第2章 哈维弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpK基因的克隆 | 第23-30页 |
| ·材料和方法 | 第23-27页 |
| ·菌株 | 第23页 |
| ·分子生物学试剂 | 第23-24页 |
| ·哈维氏弧菌总DNA的提取及OmpK成熟肽基因的扩增 | 第24-25页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第25页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第25-26页 |
| ·T载体与PCR产物的连接、转化及平板抗生素筛选 | 第26页 |
| ·碱裂解法小量制备重组质粒 | 第26-27页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定和测序鉴定 | 第27页 |
| ·结果与分析 | 第27-29页 |
| ·OmpK成熟肽基因的PCR结果 | 第27-28页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定和测序鉴定 | 第28-29页 |
| ·讨论 | 第29-30页 |
| 第3章 OmpK原核表达载体的构建、表达与纯化 | 第30-39页 |
| ·材料与方法 | 第31-34页 |
| ·质粒与菌株 | 第31页 |
| ·主要试剂 | 第31页 |
| ·质粒pMD18T-OmpK与质粒pET30a的双酶切 | 第31页 |
| ·基因OmpK与质粒pET30a的连接、转化及平板抗生素筛选 | 第31-32页 |
| ·重组表达载体的双酶切鉴定 | 第32页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第32页 |
| ·重组蛋白表达方式的检测 | 第32-33页 |
| ·重组蛋白的纯化与浓缩 | 第33-34页 |
| ·重组蛋白浓度的测定及兔多抗血清的制备 | 第34页 |
| ·结果与分析 | 第34-37页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定结果 | 第34-35页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及表达方式 | 第35-36页 |
| ·重组蛋白的纯化结果 | 第36-37页 |
| ·讨论 | 第37-39页 |
| 第4章 哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的克隆与真核分泌表达 | 第39-57页 |
| ·材料和方法 | 第40-47页 |
| ·质粒和菌株 | 第40页 |
| ·试剂与仪器 | 第40页 |
| ·外膜蛋白OmpK成熟肽基因的克隆 | 第40-42页 |
| ·重组质粒的单酶切线性化与纯化浓缩 | 第42-43页 |
| ·毕赤酵母GS115感受态细胞的制备 | 第43页 |
| ·电转化 | 第43-44页 |
| ·酵母转化子的高拷贝筛选及表型利用鉴定 | 第44页 |
| ·酵母转化子的PCR鉴定 | 第44-46页 |
| ·阳性转化子的诱导表达 | 第46页 |
| ·表达产物的Western-blot分析 | 第46-47页 |
| ·结果与分析 | 第47-55页 |
| ·OmpK成熟肽基因的PCR扩增 | 第47页 |
| ·穿梭载体pPIC9K-OmpK的PCR鉴定及双酶切鉴定 | 第47-49页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第49-50页 |
| ·电转化及表型利用 | 第50-52页 |
| ·酵母转化子的PCR鉴定 | 第52-53页 |
| ·重组蛋白诱导表达 | 第53-54页 |
| ·表达产物的Western-blotting结果 | 第54-55页 |
| ·讨论 | 第55-57页 |
| 第5章 哈维弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆与真核胞内表达 | 第57-70页 |
| ·材料和方法 | 第57-63页 |
| ·实验材料与试剂 | 第57-58页 |
| ·胞内引物的设计 | 第58页 |
| ·穿梭载体的构建 | 第58页 |
| ·氯化锂转化GS115感受态细胞的制备 | 第58-59页 |
| ·氯化锂转化 | 第59页 |
| ·酵母转化子的高拷贝筛选及表型利用鉴定 | 第59-60页 |
| ·酵母转化子基因组DNA的提取及PCR鉴定 | 第60-62页 |
| ·阳性转化子的甲醇诱导表达 | 第62页 |
| ·重组蛋白表达方式的检测 | 第62-63页 |
| ·胞内重组蛋白的Western-blot分析 | 第63页 |
| ·结果与分析 | 第63-69页 |
| ·OmpK成熟肽基因的PCR扩增 | 第63-64页 |
| ·穿梭载体pPIC3.5K-OmpK的PCR鉴定及双酶切鉴定 | 第64页 |
| ·高拷贝转化子的筛选及表型利用鉴定 | 第64-65页 |
| ·酵母转化子基因组DNA的提取及PCR鉴定结果 | 第65-67页 |
| ·重组蛋白的诱导表达结果 | 第67页 |
| ·重组蛋白的表达方式 | 第67-68页 |
| ·表达产物的Western-blotting结果 | 第68-69页 |
| ·讨论 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-80页 |
| 附录 | 第80-85页 |
| 硕士期间发表的论文和参加的学术会议 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
