| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-20页 |
| ·重要海洋鱼类病原迟钝爱德华氏菌 | 第11-12页 |
| ·海洋鱼类养殖常见病害 | 第11页 |
| ·迟钝爱德华氏菌及爱德华氏菌病 | 第11-12页 |
| ·鱼类疫苗 | 第12-14页 |
| ·疫苗概述 | 第12页 |
| ·鱼类疫苗种类 | 第12-13页 |
| ·鱼用疫苗接种方法 | 第13-14页 |
| ·体内诱导表达系统在载体疫苗中的应用 | 第14-16页 |
| ·细菌载体疫苗 | 第14页 |
| ·细菌载体疫苗优化策略 | 第14页 |
| ·体内诱导启动子种类及应用 | 第14-16页 |
| ·细菌铁载体介导的铁摄取系统 | 第16-18页 |
| ·铁的生理功能和病原-宿主铁竞争 | 第16-17页 |
| ·铁载体的结构及分类 | 第17页 |
| ·与铁摄取相关蛋白的转录和表达调控 | 第17-18页 |
| ·本论文的主要内容和意义 | 第18-20页 |
| 第2章 铁调控启动子筛选及其表达系统构建 | 第20-34页 |
| ·引言 | 第20页 |
| ·实验材料 | 第20-22页 |
| ·菌株、质粒及引物 | 第20页 |
| ·药品与试剂 | 第20页 |
| ·主要培养基 | 第20-22页 |
| ·主要仪器设备 | 第22页 |
| ·实验方法 | 第22-25页 |
| ·细菌培养及保藏 | 第22页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第22-23页 |
| ·大肠杆菌的钙转化 | 第23页 |
| ·细菌质粒和基因组提取 | 第23页 |
| ·迟钝爱德华氏菌感受态细胞的制备 | 第23页 |
| ·迟钝爱德华氏菌的电转化 | 第23页 |
| ·DNA的琼脂糖凝胶电泳 | 第23-24页 |
| ·DNA产物纯化及DNA电泳胶回收 | 第24页 |
| ·常规PCR方法 | 第24页 |
| ·菌落PCR方法 | 第24页 |
| ·铁调控启动子筛选及克隆分析 | 第24页 |
| ·表达质粒构建 | 第24-25页 |
| ·使用荧光酶标仪检测报告菌株的GFP表达量 | 第25页 |
| ·结果与讨论 | 第25-33页 |
| ·启动子筛选系统构建 | 第25-26页 |
| ·基于文献筛选铁调控启动子 | 第26-30页 |
| ·分析来源于迟钝爱德华氏菌内源铁调控启动子的区域 | 第30-32页 |
| ·来源于迟钝爱德华氏菌内源铁调控启动子体外荧光表达 | 第32-33页 |
| ·本章小结 | 第33-34页 |
| 第3章 铁调控启动子P_(yncE)和P_(dps)在巨噬细胞内转录表达 | 第34-42页 |
| ·引言 | 第34页 |
| ·实验材料 | 第34-35页 |
| ·细胞株、菌株、质粒及引物 | 第34页 |
| ·药品与试剂 | 第34-35页 |
| ·常规培养基 | 第35页 |
| ·微生物培养基 | 第35页 |
| ·细胞培养基 | 第35页 |
| ·常规培养基 | 第35页 |
| ·主要仪器设备 | 第35页 |
| ·实验方法 | 第35-37页 |
| ·细菌培养及保藏 | 第35页 |
| ·细胞密度测定 | 第35-36页 |
| ·分子生物学克隆技术 | 第36页 |
| ·巨噬细胞样细胞J744A培养 | 第36页 |
| ·侵染及定殖能力的测定 | 第36页 |
| ·E.coli H1717感受态制备 | 第36页 |
| ·流式细胞术测定基因转录 | 第36页 |
| ·Fur滴定实验 | 第36-37页 |
| ·倒置荧光显微镜观察 | 第37页 |
| ·结果与讨论 | 第37-41页 |
| ·生长曲线测定 | 第37-38页 |
| ·细菌侵袭能力测定 | 第38页 |
| ·重组菌侵染巨噬细胞J774A | 第38-39页 |
| ·启动子P_(dps)转录受铁和fur调控的分析 | 第39-41页 |
| ·P_(dps)转录受过氧化氢调控的分析 | 第41页 |
| ·本章小结 | 第41-42页 |
| 第4章 铁调控启动子P_(dps)在斑马鱼体内诱导表达 | 第42-53页 |
| ·引言 | 第42页 |
| ·实验材料 | 第42-43页 |
| ·菌株、质粒及引物 | 第42页 |
| ·药品与试剂 | 第42-43页 |
| ·常规培养基 | 第43页 |
| ·微生物培养基 | 第43页 |
| ·缓冲液 | 第43页 |
| ·主要仪器设备 | 第43页 |
| ·实验方法 | 第43-47页 |
| ·细菌培养及保藏 | 第43页 |
| ·斑马鱼交配与饲养 | 第43-44页 |
| ·斑马鱼系统养殖 | 第43页 |
| ·斑马鱼交配 | 第43页 |
| ·受精卵孵化及幼鱼饲养 | 第43-44页 |
| ·受精卵孵化及幼鱼饲养 | 第44页 |
| ·常规分子克隆 | 第44-45页 |
| ·重组质粒体外稳定性测试 | 第45页 |
| ·感染后幼鱼体内菌落计数及荧光显微镜观察 | 第45页 |
| ·斑马鱼幼鱼冷冻切片 | 第45页 |
| ·苏木精-伊红染色 | 第45页 |
| ·体内诱导表达系统转化迟钝爱德华氏菌缺失株 | 第45页 |
| ·重组减毒株感染成年斑马鱼 | 第45-46页 |
| ·斑马鱼样品处理 | 第46页 |
| ·使用SDS-PAGE检测蛋白 | 第46页 |
| ·使用Western-blot法检测GFP | 第46-47页 |
| ·结果与讨论 | 第47-52页 |
| ·在斑马鱼幼鱼体内定殖 | 第47页 |
| ·P_(dps)在斑马鱼幼鱼中转录表达 | 第47-49页 |
| ·重组质粒稳定性分析 | 第49-50页 |
| ·在候选疫苗株中构建体内诱导表达系统 | 第50-51页 |
| ·Western-blot检测分析GFP在斑马鱼体内的表达 | 第51-52页 |
| ·本章小结 | 第52-53页 |
| 第5章 在大菱鲆中评价迟钝爱德华氏菌多价载体疫苗的效果 | 第53-62页 |
| ·引言 | 第53页 |
| ·实验材料 | 第53-54页 |
| ·菌株、质粒及引物 | 第53-54页 |
| ·试剂与培养基 | 第54页 |
| ·实验方法 | 第54-55页 |
| ·细菌培养及保藏 | 第54页 |
| ·多价疫苗载体构建 | 第54-55页 |
| ·疫苗株对大菱鲆免疫效果的测定 | 第55页 |
| ·结果与讨论 | 第55-61页 |
| ·外源蛋白基因gapA34的克隆及载体质粒制备 | 第55-56页 |
| ·基于体内诱导抗原表达质粒pUTDgap构建重组载体疫苗 | 第56-57页 |
| ·E.tarda EIB202半致死剂量 | 第57页 |
| ·E.tarda EIB202感染大菱鲆病症 | 第57-58页 |
| ·载体疫苗候选株大菱鲆保护效果评价 | 第58-61页 |
| ·本章小结 | 第61-62页 |
| 第6章 总结与展望 | 第62-65页 |
| ·总结 | 第62-63页 |
| ·展望 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-69页 |
| 附录 | 第69-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
