| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-16页 |
| 实验材料及方法 | 第16-37页 |
| (一) 实验材料 | 第16-18页 |
| 1、菌株 | 第16页 |
| 2、质粒 | 第16页 |
| 3、酶 | 第16-17页 |
| 4、分子量标准 | 第17页 |
| 5、试剂盒 | 第17页 |
| 6、主要试剂 | 第17页 |
| 7、透析袋 | 第17-18页 |
| 8、PVDF膜 | 第18页 |
| 9、实验动物 | 第18页 |
| 10、主要仪器 | 第18页 |
| (二) eCD基因在大肠杆菌中的克隆以及融合蛋白的表达纯化 | 第18-24页 |
| 1、eCD全基因的合成 | 第18-21页 |
| 2、重组表达质粒pThioHisA-eCD的构建 | 第21-23页 |
| 3、重组质粒pThioHisA-eCD诱导条件的优化 | 第23-24页 |
| 4、pThioHisA-eCD融合蛋白的纯化 | 第24页 |
| 5、pThioHisA-eCD融合蛋白的复性 | 第24页 |
| (三) 重组蛋白pThioHisA-eCD免疫豚鼠抗体的制备 | 第24-25页 |
| (四) yCD基因在毕赤酵母中的克隆、表达及纯化 | 第25-36页 |
| 1、yCD全基因的合成 | 第25-28页 |
| 2、重组表达质粒pPIC9K-α-yCD的构建 | 第28-34页 |
| 3、重组质粒pPIC9K-α-yCD转化毕赤酵母GS115、G418加压筛选多拷贝转化子和转化子鉴定 | 第34-35页 |
| 4、重组毕赤酵母菌诱导表达及纯化 | 第35-36页 |
| 5、Western blOt | 第36页 |
| 6、测定蛋白浓度 | 第36页 |
| (五) 抗菌肽Cecropin D的体外抗菌活性鉴定 | 第36-37页 |
| 1、琼脂糖扩散法 | 第36页 |
| 2、比浊法 | 第36-37页 |
| 实验结果与分析 | 第37-53页 |
| (一) eCD基因在大肠杆菌中的克隆及融合蛋白的表达纯化 | 第37-41页 |
| 1、eCD基因片段的合成 | 第37页 |
| 2、重组表达质粒pThioHisA-eCD的构建 | 第37页 |
| 3、重组质粒pThioHisA-eCD诱导条件的优化 | 第37-39页 |
| 4、pThioHisA-eCD融合蛋白的纯化 | 第39-41页 |
| (二) yCD基因在毕赤酵母中的克隆、表达及纯化 | 第41-45页 |
| 1、yCD基因片段的合成 | 第41页 |
| 2、α因子的获得 | 第41-42页 |
| 3、α-yCD融合基因的获得 | 第42页 |
| 4、重组质粒pPIC9K-α-yCD的构建 | 第42-43页 |
| 5、筛选及鉴定多拷贝的转化子 | 第43-44页 |
| 6、Cecropin D的诱导表达、纯化及Tricine-SDS-PAGE | 第44-45页 |
| 7、Western Blot | 第45页 |
| (三) 纯化后抗菌肽Cecropin D浓度的测定 | 第45-46页 |
| (四) 抗菌肽Cecropin D的体外抗菌活性鉴定及热稳定性研究 | 第46-53页 |
| 1、琼脂糖扩散法 | 第46-48页 |
| 2、比浊法 | 第48-51页 |
| 3、抗菌肽Cecropin D的热稳定性研究 | 第51-53页 |
| 讨论 | 第53-60页 |
| (一) 表达系统的选择 | 第53-54页 |
| (二) 抗菌肽Cecropin D全基因片断的合成 | 第54页 |
| (三) 融合蛋白pThioHisA-eCD的表达及包涵体的处理 | 第54-55页 |
| (四) 融合蛋白pThioHisA-eCD的纯化及复性 | 第55-56页 |
| (五) α因子信号肽的选择 | 第56页 |
| (六) 高拷贝转化子的筛选 | 第56页 |
| (七) 抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达及纯化 | 第56-57页 |
| (八) Tricine-SDS-PAGE | 第57-58页 |
| (九) 抗菌肽Cecropin D的体外抗菌活性及其热稳定性 | 第58-60页 |
| 小结 | 第60-61页 |
| 展望 | 第61-62页 |
| 论文参考文献 | 第62-66页 |
| 论文综述 | 第66-75页 |
| 附录 | 第75-89页 |
| 致谢 | 第89-90页 |
| 研究生简历 | 第90-91页 |
