| 中文摘要 | 第1-16页 |
| Abstract | 第16-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-50页 |
| 1 禽流感病毒研究进展 | 第20-43页 |
| ·禽流感病毒的分类、命名 | 第20-21页 |
| ·禽流感的发生及危害 | 第21-23页 |
| ·禽流感病毒的形态结构及其理化特性 | 第23-25页 |
| ·禽流感病毒分子生物学研究进展 | 第25-31页 |
| ·禽流感病毒的基因组 | 第25页 |
| ·禽流感病毒的蛋白结构 | 第25-31页 |
| ·禽流感病毒的复制 | 第31-32页 |
| ·病毒粒子的吸附、侵入与脱壳 | 第31页 |
| ·基因组的转录和复制 | 第31页 |
| ·AIV基因表达的调控 | 第31-32页 |
| ·AIV的装配与释放 | 第32页 |
| ·禽流感与人禽流感 | 第32-36页 |
| ·禽流感的防治 | 第36-37页 |
| ·综合防治 | 第36页 |
| ·疫苗接种 | 第36-37页 |
| ·疫区的控制 | 第37页 |
| ·禽流感疫苗研究进展 | 第37-43页 |
| ·灭活全病毒疫苗 | 第37-38页 |
| ·纯化组分疫苗 | 第38-39页 |
| ·减毒活疫苗 | 第39页 |
| ·重组亚单位疫苗 | 第39-40页 |
| ·重组活载体疫苗 | 第40页 |
| ·合成多肽疫苗 | 第40-41页 |
| ·核酸疫苗 | 第41页 |
| ·RNAi疫苗 | 第41-43页 |
| 2 粘膜免疫研究进展 | 第43-50页 |
| ·粘膜免疫系统基本组成 | 第44-45页 |
| ·粘膜免疫系统的诱导与效应细胞 | 第45-46页 |
| ·分泌型IgA作用 | 第46-47页 |
| ·粘膜免疫的优点 | 第47页 |
| ·粘膜疫苗佐剂 | 第47-50页 |
| 第二章 禽流感病毒M2蛋白及其膜外序列的多肽疫苗研究 | 第50-87页 |
| 1 前言 | 第50-56页 |
| ·基于M2蛋白及其M2e表位的疫苗研究进展 | 第50-54页 |
| ·本研究的目的和内容 | 第54-56页 |
| 2 材料与方法 | 第56-69页 |
| ·材料、载体、菌株、工具酶 | 第56页 |
| ·主要试剂及溶液的配制 | 第56-58页 |
| ·质粒抽提相关溶液 | 第56页 |
| ·SDS-PAGE相关溶液 | 第56-57页 |
| ·Western blotting相关溶液 | 第57页 |
| ·ELISA所用试剂 | 第57-58页 |
| ·蛋白纯化相关试剂 | 第58页 |
| ·其它相关溶液 | 第58页 |
| ·引物设计和序列分析 | 第58-59页 |
| ·M基因的克隆 | 第59-62页 |
| ·PCR引物 | 第59页 |
| ·病毒RNA提取 | 第59页 |
| ·RT-PCR | 第59-60页 |
| ·M基因的TA克隆 | 第60-61页 |
| ·序列测定及分析 | 第61-62页 |
| ·M2基因及缺失跨膜区的M2基因的克隆 | 第62页 |
| ·基于M2基因膜外序列的融合基因构建 | 第62-63页 |
| ·M2e比对及密码子优化 | 第62页 |
| ·PCR引物 | 第62-63页 |
| ·M2eHBc和M2eHBc+融合基因片段的获得 | 第63页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第63-64页 |
| ·pET32a-△M2原核表达载体的构建 | 第63-64页 |
| ·pMALc2x-M2eHBc和 pMALc2x-M2eHBc+原核表达载体的构建 | 第64页 |
| ·目的基因的诱导表达 | 第64-65页 |
| ·缺失跨膜区的M2蛋白表达 | 第64页 |
| ·M2eHBc和M2eHBc+融合蛋白表达 | 第64页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第64-65页 |
| ·原核表达重组蛋白纯化及浓度测定 | 第65页 |
| ·表达产物的抗原性分析 | 第65-66页 |
| ·纯化表达蛋白的交叉抗原性检测 | 第66-67页 |
| ·电镜观察原核表达的融合蛋白 | 第67页 |
| ·免疫小鼠 | 第67页 |
| ·抗体效价检测 | 第67-69页 |
| ·血清收集方法 | 第67页 |
| ·HBcAg抗体检测 | 第67-68页 |
| ·M2特异性抗体效价检测 | 第68-69页 |
| 3 结果与分析 | 第69-83页 |
| ·M基因RT-PCR扩增和重组载体pMD18T-M鉴定 | 第69页 |
| ·M基因序列比对及分子进化分析 | 第69-72页 |
| ·缺失跨膜区的M2基因扩增及pET32a-△M2鉴定 | 第72-73页 |
| ·M2e与HBcAg融合基因的扩增及原核表达载体鉴定 | 第73-75页 |
| ·融合蛋白的表达及蛋白表达形式分析 | 第75-77页 |
| ·pET32a-OM2表达分析 | 第75-76页 |
| ·pMALc2x-M2eHBc和pMALc2x-M2eHBc+表达分析 | 第76-77页 |
| ·原核表达的融合蛋白抗原性分析 | 第77-79页 |
| ·融合蛋白的交叉反应性检测 | 第79-80页 |
| ·电镜观察结果 | 第80-81页 |
| ·抗体效价检测 | 第81-83页 |
| ·抗血清中HBcAg抗体 | 第81页 |
| ·抗血清中M2抗体效价 | 第81-83页 |
| 4 讨论 | 第83-87页 |
| ·M基因的克隆与序列分析 | 第83页 |
| ·融合基因的构建 | 第83页 |
| ·外源基因的原核表达 | 第83-84页 |
| ·病毒样颗粒 | 第84-85页 |
| ·融合蛋白交叉抗原性及抗体效价 | 第85-87页 |
| 第三章 LTB的克隆与表达及其与M2eHBc+蛋白的粘膜免疫研究 | 第87-115页 |
| 1 前言 | 第87-96页 |
| ·LT与CT的结构与功能 | 第87-89页 |
| ·LT和CT的粘膜免疫佐剂研究 | 第89-91页 |
| ·LT与CT B亚单位的免疫佐剂研究 | 第91-94页 |
| ·本研究的目的和内容 | 第94-96页 |
| 2 材料与方法 | 第96-101页 |
| ·材料、载体、菌株、工具酶 | 第96页 |
| ·LT基因的克隆 | 第96-97页 |
| ·PCR模板制备、引物设计及PCR扩增 | 第96-97页 |
| ·LT基因的TA克隆 | 第97页 |
| ·LTB的原核表达载体构建 | 第97页 |
| ·LTB PCR引物合成、PCR扩增 | 第97页 |
| ·pET32a-LTB原核表达载体构建 | 第97页 |
| ·LTB亚单位与M2eHBc+的融合表达载体构建 | 第97-98页 |
| ·目的基因的诱导表达 | 第98页 |
| ·表达产物抗原性分析 | 第98-99页 |
| ·体外GM1-ELISA检测 | 第99页 |
| ·电镜观察原核表达的融合蛋白LBM2eHBc+ | 第99页 |
| ·小鼠免疫接种 | 第99页 |
| ·抗体效价检测 | 第99-101页 |
| ·免疫血清及肠分泌液制备 | 第99-100页 |
| ·血清抗原特异性IgG效价检测 | 第100页 |
| ·肠分泌液中抗原特异性IgA检测 | 第100-101页 |
| 3 结果与分析 | 第101-111页 |
| ·LT全长基因的克隆及序列分析 | 第101页 |
| ·pET32a-LTB原核表达载体构建 | 第101-102页 |
| ·pMALc2x-LBM2eHBc+原核表达载体的构建 | 第102-103页 |
| ·融合蛋白的表达及蛋白表达形式 | 第103-105页 |
| ·pET32a-LTB的表达 | 第103-104页 |
| ·pMALc2x-LBM2eHBc+的原核表达 | 第104-105页 |
| ·重组蛋白的抗原性分析 | 第105-107页 |
| ·重组蛋白的GM1-ELISA | 第107页 |
| ·电镜观察结果 | 第107-108页 |
| ·抗体效价检测 | 第108-111页 |
| ·血清M2特异性IgG检测结果 | 第108-109页 |
| ·肠冲洗液M2特异性IgA检测结果 | 第109-111页 |
| 4 讨论 | 第111-115页 |
| ·原核表达系统中目的蛋白的可溶性表达 | 第111-112页 |
| ·LTB对共免疫原的粘膜佐剂活性 | 第112-115页 |
| 第四章 M2eHBc+融合基因的DNA疫苗免疫研究 | 第115-137页 |
| 1 前言 | 第115-122页 |
| ·DNA疫苗 | 第115-118页 |
| ·DNA疫苗的发展及其优点 | 第115-116页 |
| ·DNA疫苗诱发机体产生免疫保护的机制 | 第116-117页 |
| ·加强DNA免疫效应的策略 | 第117页 |
| ·DNA疫苗与其它疫苗的二次免疫(初免-加强)策略 | 第117-118页 |
| ·DNA疫苗与粘膜免疫 | 第118-120页 |
| ·禽流感病毒DNA疫苗的研究 | 第120-121页 |
| ·本研究的目的与内容 | 第121-122页 |
| 2 材料与方法 | 第122-128页 |
| ·实验材料 | 第122页 |
| ·主要试剂及溶液的配制 | 第122-123页 |
| ·质粒大量抽提所需试剂配制 | 第122页 |
| ·细胞培养及转染相关试剂配制 | 第122-123页 |
| ·T细胞增殖试验相关试剂配制 | 第123页 |
| ·pcDNA3-LTB、 pcDNA3-M2eHBc+及pcDNA3-LBM2eHBc+构建 | 第123-124页 |
| ·转染及免疫用质粒的制备及浓度纯度测定 | 第124-125页 |
| ·转染及免疫用质粒的制备 | 第124-125页 |
| ·质粒浓度及质粒纯度测定 | 第125页 |
| ·体外转染哺乳动物细胞 | 第125-126页 |
| ·免疫小鼠 | 第126页 |
| ·IgG和IgA抗体效价检测 | 第126-127页 |
| ·T细胞增殖试验 | 第127-128页 |
| ·小鼠脾脏淋巴细胞分离 | 第127页 |
| ·T细胞增殖试验(MTT法) | 第127-128页 |
| 3 结果与分析 | 第128-134页 |
| ·DNA疫苗相关载体的构建 | 第128页 |
| ·体外转染Western blotting分析 | 第128-129页 |
| ·DNA疫苗抗体检测结果 | 第129-131页 |
| ·血清IgG-M2检测结果 | 第129-130页 |
| ·肠洗液IgA-M2检测结果 | 第130-131页 |
| ·T细胞增殖的试验结果 | 第131-134页 |
| 4 讨论 | 第134-137页 |
| 第五章 毕氏酵母表达的LBM2eHBc+重组基因多肽疫苗及其抗原性分析 | 第137-152页 |
| 1 前言 | 第137-140页 |
| 2 材料与方法 | 第140-145页 |
| ·材料 | 第140页 |
| ·毕氏酵母表达所用各种试剂与溶剂的配制 | 第140-141页 |
| ·LBM2eHBc+融合基因毕氏酵母表达载体的构建 | 第141-142页 |
| ·LBM2eHBc+融合基因转化毕氏酵母GS115 | 第142-143页 |
| ·GS115感受态的制备 | 第142页 |
| ·重组表达载体pPIC9K-LBM2eHBc+线性化 | 第142页 |
| ·表达载体pPIC9K-LBM2eHBc+转化GS115感受态细胞 | 第142-143页 |
| ·LBM2eHBc+融合基因在毕氏酵母GS115中的表达 | 第143-144页 |
| ·转化子的PCR快速鉴定 | 第143页 |
| ·阳性转化子的Dot-ELISA鉴定 | 第143页 |
| ·酵母整合的PCR分析 | 第143-144页 |
| ·融合基因在酵母中的表达 | 第144页 |
| ·表达蛋白的SDS-PAGE分析及Western-blotting分析 | 第144-145页 |
| 3 结果与分析 | 第145-149页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第145页 |
| ·转化GS115阳性克隆的PCR鉴定及Dot-ELISA鉴定 | 第145-147页 |
| ·PCR分析外源基因在酵母中的整合 | 第147页 |
| ·外源基因的诱导表达 | 第147-148页 |
| ·表达蛋白的Western blotting分析 | 第148-149页 |
| 4 讨论 | 第149-152页 |
| 结论与展望 | 第152-154页 |
| 其它研究工作 | 第154-155页 |
| 参考文献 | 第155-170页 |
| 缩略词 | 第170-171页 |
| 致谢 | 第171-172页 |
