| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 1 引言 | 第9-16页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第9页 |
| ·国内外研究现状及进展 | 第9-15页 |
| ·GOD 的应用 | 第10-12页 |
| ·关于 GOD 酶活力测定的研究 | 第12-13页 |
| ·关于酶的分子水平的研究 | 第13-14页 |
| ·毕赤酵母表达系统研究进展 | 第14-15页 |
| ·主要内容和总体目标 | 第15-16页 |
| 2 材料与方法 | 第16-29页 |
| ·试验材料 | 第16-18页 |
| ·菌株与质粒 | 第16页 |
| ·酶及生化试剂 | 第16页 |
| ·培养基及有关的溶液配制 | 第16-17页 |
| ·主要设备 | 第17-18页 |
| ·黑曲霉 A9 GOD 基因的克隆与测序 | 第18-21页 |
| ·黑曲霉 A9 的培养 | 第18页 |
| ·黑曲霉 A9 总 DNA 的提取(研磨-CTAB 法) | 第18页 |
| ·引物的设计与合成 | 第18-19页 |
| ·反应条件和反应体系 | 第19页 |
| ·扩增产物的回收 | 第19页 |
| ·克隆质粒 pMD18-T-GOD 的构建 | 第19-20页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第20页 |
| ·克隆质粒的转化 | 第20页 |
| ·SDS 碱裂解法小量制备质粒 DNA | 第20-21页 |
| ·阳性克隆的筛选与鉴定 | 第21页 |
| ·GOD 基因的测序与分析 | 第21页 |
| ·黑曲霉 A9 GOD 基因表达载体的构建及鉴定 | 第21-22页 |
| ·毕赤酵母细胞的转化 | 第22-24页 |
| ·重组表达载体的线性化 | 第22页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备及转化 | 第22-23页 |
| ·甲醇利用表型的确定 | 第23页 |
| ·多拷贝转化子的筛选 | 第23页 |
| ·酵母基因组 DNA 的提取 | 第23页 |
| ·重组酵母的 PCR 验证 | 第23页 |
| ·目的基因在毕赤酵母中的表达 | 第23-24页 |
| ·转化子遗传稳定性实验 | 第24页 |
| ·分析方法 | 第24-29页 |
| ·SDS-PAGE 凝胶的制备及发酵上清液的蛋白质电泳 | 第24页 |
| ·GOD 活性的测定 | 第24-25页 |
| ·可溶性蛋白的测定 | 第25-26页 |
| ·酶蛋白含糖量的测定 | 第26-27页 |
| ·表达产物的分离纯化 | 第27页 |
| ·重组酵母 GOD 的酶学性质研究 | 第27-29页 |
| 3 结果与分析 | 第29-45页 |
| ·黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆 | 第29页 |
| ·GOD 基因测序及序列分析 | 第29-31页 |
| ·GOD 基因表达载体的构建及鉴定 | 第31-32页 |
| ·GOD 基因在毕赤酵母中的表达及表达产物分析 | 第32-36页 |
| ·重组酵母甲醇利用表型的确定 | 第32-33页 |
| ·多拷贝转化子的筛选 | 第33页 |
| ·重组毕赤酵母的 PCR 鉴定 | 第33-34页 |
| ·高表达量重组酵母的筛选 | 第34页 |
| ·重组毕赤酵母的摇瓶诱导 | 第34-35页 |
| ·转化子遗传稳定性实验 | 第35页 |
| ·发酵液上清 SDS-PAGE 检测 | 第35-36页 |
| ·DEAE-52 纤维素离子交换层析 | 第36-37页 |
| ·Sephacryl~(TM)S-200 分子筛层析 | 第37-38页 |
| ·酶的分离纯化结果 | 第38页 |
| ·重组酵母 GOD 的酶学性质 | 第38-45页 |
| ·酶的分子量 | 第38-39页 |
| ·酶的糖基化程度 | 第39页 |
| ·pH 对酶活性的影响 | 第39-40页 |
| ·酶的 pH 稳定性 | 第40-41页 |
| ·温度对酶活性的影响 | 第41-42页 |
| ·酶的热稳定性 | 第42页 |
| ·金属离子及一些化学试剂对酶活的影响 | 第42-43页 |
| ·酶蛋白动力学常数 | 第43-45页 |
| 4 讨论 | 第45-48页 |
| ·黑曲霉 A9 胞内 GOD 基因在毕赤酵母中的分泌表达 | 第45页 |
| ·重组酵母 GOD 的酶学特性 | 第45-47页 |
| ·进一步提高 GOD 基因在毕赤酵母中活性及其表达量的措施 | 第47-48页 |
| 5 结论 | 第48-49页 |
| 6 参考文献 | 第49-54页 |
| 7 在读期间发表的学术论文 | 第54-55页 |
| 8 作者简历 | 第55-56页 |
| 9 致谢 | 第56页 |
