| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 一.前言 | 第9-26页 |
| 1.文献综述: | 第9-23页 |
| ·骨的发生 | 第9-10页 |
| ·成骨细胞分化过程中主要转录因子的研究及进展 | 第10-16页 |
| ·Osterix调控机制的研究和进展 | 第16-18页 |
| ·Real-Time Quantitative PCR概述 | 第18-21页 |
| ·双荧光素酶报告基因测试系统(DLR)概述 | 第21-23页 |
| 2.本论文的研究内容及意义 | 第23-25页 |
| ·研究内容 | 第23-24页 |
| ·研究意义 | 第24-25页 |
| 3.研究思路 | 第25-26页 |
| ·Real-Time Q-PCR检测Osterix基因是否在RNA水平上受到调控 | 第25页 |
| ·BMP-2相关的Osterix启动子核心区域探寻 | 第25-26页 |
| 二.实验仪器与材料 | 第26-31页 |
| 1.主要仪器 | 第26-27页 |
| 2.材料 | 第27-31页 |
| ·细胞株及质粒 | 第27页 |
| ·工具酶和试剂盒 | 第27-28页 |
| ·常用试剂及配方 | 第28-31页 |
| 三.实验方法 | 第31-47页 |
| 1.BMP-2诱导C2C12,C3H10T1/2和MC3T3-E1,并检测Osterix的表达 | 第31-36页 |
| ·细胞的BMP-2诱导 | 第31页 |
| ·细胞总RNA的抽提 | 第31-32页 |
| ·用DNase Ⅰ(RNase free)处理RNA | 第32页 |
| ·总RNA纯度和完整性检测 | 第32-33页 |
| ·逆转录 | 第33页 |
| ·常规PCR检测逆转录是否成功 | 第33-34页 |
| ·Real-Time Q-PCR检测Osterix表达水平 | 第34-36页 |
| 2、Osterix启动子缺失突变的Luciferase报告载体构建 | 第36-44页 |
| ·实验设计 | 第36-38页 |
| ·BAC的制备 | 第38页 |
| ·PCR扩增 | 第38-40页 |
| ·切胶回收纯化PCR或酶切产物 | 第40-41页 |
| ·酶切反应 | 第41页 |
| ·连接反应 | 第41-42页 |
| ·点击转化宿主大肠杆菌 | 第42页 |
| ·重组子的快速鉴定 | 第42-43页 |
| ·质粒抽提 | 第43页 |
| ·双酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 3.BMP-2相关的Osterix核心启动元件的探寻 | 第44-47页 |
| ·实验设计 | 第44页 |
| ·转染用质粒制备 | 第44-45页 |
| ·质粒转染C2C12,C3H10T1/2和MC3T3-E1细胞 | 第45页 |
| ·BMP-2诱导转染后的细胞 | 第45页 |
| ·Dual-Luciferase Reporter Assay System检测Luciferase活性 | 第45-47页 |
| 四.结果与分析 | 第47-58页 |
| 1.BMP-2分别诱导C2C12,C3H10T1/2和MC3T3-E1,并检测Osterix的表达 | 第47-50页 |
| ·细胞总RNA的纯度和完整性检测 | 第47页 |
| ·常规PCR检测逆转录 | 第47-48页 |
| ·Real-Time Q-PCR检测不同样本的Osterix表达水平 | 第48-49页 |
| ·小结 | 第49-50页 |
| 2.Osterix启动子区域生物信息学分析 | 第50-52页 |
| ·不同种属Osterix启动子区域高度保守区探寻 | 第50页 |
| ·Osterix启动子区域转录因子结合位点预测 | 第50-52页 |
| 3.Osterix启动子缺失突变的Luciferase报告载体构建 | 第52-54页 |
| ·PCR扩增 | 第52-53页 |
| ·载体鉴定 | 第53-54页 |
| 4.BMP-2相关的Osterix核心启动元件的探寻 | 第54-57页 |
| 小结 | 第57-58页 |
| 五.讨论 | 第58-62页 |
| 1.细胞株的选择策略 | 第58页 |
| 2.启动子区域的预测 | 第58-60页 |
| 3.启动子核心区域探寻及结果分析 | 第60-62页 |
| 六.总结与展望 | 第62-64页 |
| 1.总结 | 第62页 |
| 2.展望 | 第62-64页 |
| 七.参考文献 | 第64-67页 |
| 八.附录 | 第67-69页 |
| 1.pGL3-NBOP1.3K克隆测序结果图谱 | 第67-68页 |
| 2.pGL3-NBOP1.3K全序列 | 第68-69页 |
| 九.致谢 | 第69页 |
