| 原创性声明 | 第1页 |
| 学位论文版权使用授权书 | 第3-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-20页 |
| 1 免疫球蛋白的概述 | 第11-15页 |
| ·免疫球蛋白的结构 | 第11-14页 |
| ·一级结构—两个基因,一条多肽 | 第12-13页 |
| ·二级结构—免疫球蛋白的折叠 | 第13页 |
| ·三级结构—免疫球蛋白的结构域 | 第13页 |
| ·四级结构—免疫球蛋白单体 | 第13-14页 |
| ·更高级的免疫球蛋白结构—多聚免疫球蛋白 | 第14页 |
| ·免疫球蛋白的功能 | 第14-15页 |
| 2 IgM概述 | 第15-17页 |
| ·IgM的产生及其多样性产生的分子机制 | 第15-16页 |
| ·IgM的结构与功能 | 第16-17页 |
| ·IgM五聚体结构 | 第16-17页 |
| ·IgM的功能 | 第17页 |
| 3 抗IgM单抗的研究进展 | 第17-18页 |
| 4 本论文研究概述 | 第18-20页 |
| ·本论文的主要研究内容 | 第18-19页 |
| ·本论文研究意义及应用前景 | 第19-20页 |
| 第二章 cIgMμ、pIgMμ、bIgMμ基因的获取和序列测定 | 第20-27页 |
| 1 材料和方法 | 第20-24页 |
| ·质粒与菌种 | 第20页 |
| ·扩增引物 | 第20页 |
| ·主要试剂 | 第20页 |
| ·外周血淋巴细胞的分离 | 第20-21页 |
| ·Trizol法从外周血淋巴细胞中提取总RNA | 第21页 |
| ·oligo(dT)—纤维素层析法从总RNA中提取PolyA~+ mRNA | 第21页 |
| ·反转录合成cDNA及PCR反应扩增目的IgMμ片段 | 第21-22页 |
| ·一步法制备DH5a大肠杆菌感受态细胞 | 第22-23页 |
| ·目的基因的序列测定 | 第23-24页 |
| ·处理载体pBluescriptⅡKS | 第23页 |
| ·目的片断与质粒连接(连接体系5μL) | 第23页 |
| ·连接产物转化 | 第23页 |
| ·重组pBlue-IgMμ质粒的筛选与鉴定 | 第23-24页 |
| ·重组质粒pBlue-IgMμ序列测定 | 第24页 |
| 2 结果 | 第24-26页 |
| ·IgMμ RT-PCR扩增 | 第24页 |
| ·重组质粒pBlue-IgMμ的鉴定结果 | 第24-25页 |
| ·IgMμ片段碱基序列测定结果 | 第25-26页 |
| 3 讨论 | 第26-27页 |
| 第三章 原核表达IgMμ_原蛋白及多抗制备 | 第27-38页 |
| 1 材料和方法 | 第27-32页 |
| ·质粒与菌种 | 第27页 |
| ·扩增引物 | 第27页 |
| ·主要试剂 | 第27页 |
| ·pET-30a-IgMμ_原原核表达质粒的构建 | 第27-29页 |
| ·IgMμ_原基因片断的PCR扩增和测序 | 第27-28页 |
| ·pET-30a-IgMμ_原质粒的构建 | 第28页 |
| ·pET-30a-IgMμ_原质粒的鉴定 | 第28-29页 |
| ·原核表达IgMμ_原蛋白及SDS-PAGE | 第29-31页 |
| ·原核表达IgMμ_原蛋白的纯化 | 第31-32页 |
| ·Ni-NTA柱的处理 | 第31页 |
| ·细菌裂解物的制备 | 第31页 |
| ·IgMμ_原蛋白的纯化 | 第31-32页 |
| ·原核表达IgMμ_原蛋白的透析 | 第32页 |
| ·抗IgMμ_原多克隆抗血清的制备 | 第32页 |
| 2 结果 | 第32-37页 |
| ·PCR扩增IgMμ_原原核表达片断 | 第32页 |
| ·pET-30a-IgMμ_原的酶切鉴定结果 | 第32-34页 |
| ·原核表达IgMμ_原蛋白的鉴定 | 第34-37页 |
| ·间接ELISA测定兔抗IgMμ_原蛋白高免血清的抗体效价 | 第37页 |
| 3 讨论 | 第37-38页 |
| 第四章 重组杆状病毒表达IgMμ_真蛋白及其抗原性研究 | 第38-53页 |
| 1 材料和方法 | 第39-46页 |
| ·质粒与菌种 | 第39页 |
| ·扩增引物 | 第39-40页 |
| ·主要试制 | 第40页 |
| ·重组转移载体pFastBac~(TM)1-IgMμ_真的构建 | 第40-42页 |
| ·IgMμ_真基因片断的PCR扩增和测序 | 第40-41页 |
| ·pFastBac~(TM)1-IgMμ_真转移载体的构建 | 第41页 |
| ·pFastBac~(TM)1-IgMμ_真转移载体的提取和鉴定 | 第41-42页 |
| ·同源重组构建rBacmid-IgMμ_真及其PCR鉴定 | 第42-44页 |
| ·重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-IgMμ_真的构建 | 第42页 |
| ·重组杆状病毒穿梭质粒DNA的提取 | 第42-43页 |
| ·重组穿梭质粒rBacmid-IgMμ_真的PCR鉴定 | 第43-44页 |
| ·重组杆状病毒rBac-IgMμ_真及PCR鉴定 | 第44-45页 |
| ·细胞准备 | 第44页 |
| ·转染混合物的准备 | 第44页 |
| ·转染 | 第44页 |
| ·重组杆状病毒DNA的提取及鉴定 | 第44-45页 |
| ·重组杆状病毒的毒力扩增 | 第45页 |
| ·间接免疫荧光检测重组杆状病毒表达蛋白 | 第45页 |
| ·间接ELISA检测重组杆状病毒表达蛋白 | 第45-46页 |
| ·重组杆状病毒表达蛋白的Western Blot检测 | 第46页 |
| ·重组杆状病毒表达蛋白的SDS-PAGE电泳 | 第46页 |
| ·电转移 | 第46页 |
| ·Western Blot | 第46页 |
| 2 结果 | 第46-51页 |
| ·PCR扩增IgMμ_真片断 | 第46-47页 |
| ·IgMμ_真序列测定 | 第47页 |
| ·重组质粒pFastBac~(TM)1-IgMμ_真的鉴定 | 第47-48页 |
| ·重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-IgMμ_真的鉴定 | 第48页 |
| ·重组杆状病毒的PCR鉴定 | 第48-49页 |
| ·间接免疫荧光(IFA)分析 | 第49-50页 |
| ·重组杆状病毒表达蛋白的检测 | 第50-51页 |
| ·重组杆状病毒表达蛋白的Western Blot检测 | 第51页 |
| 3 讨论 | 第51-53页 |
| 第五章 抗IgMμ_原单克隆抗体的制备 | 第53-64页 |
| 1 材料和方法 | 第53-58页 |
| ·免疫原 | 第53页 |
| ·细胞系与实验动物 | 第53页 |
| ·主要试剂及培养基 | 第53页 |
| ·动物免疫 | 第53页 |
| ·抗原包被最佳浓度与对照血清最佳稀释度的确定 | 第53-54页 |
| ·骨髓瘤细胞的复苏、培养与制备 | 第54页 |
| ·饲养细胞制备 | 第54页 |
| ·脾细胞的制备 | 第54-55页 |
| ·细胞融合 | 第55页 |
| ·阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第55页 |
| ·杂交瘤细胞的克隆化、冻存和复苏 | 第55-56页 |
| ·单克隆抗体腹水的制备 | 第56页 |
| ·杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定 | 第56-57页 |
| ·腹水效价的测定 | 第56页 |
| ·抗体亚类的测定 | 第56-57页 |
| ·抗cIgMμ_原单克隆抗体与猪、牛及鸡血清中IgM的免疫反应性 | 第57-58页 |
| ·血清中IgM的粗提 | 第57页 |
| ·Toyopearl HW-55柱层析纯化IgM | 第57页 |
| ·间接ELISA检测单抗的免疫反应性 | 第57-58页 |
| 2 结果 | 第58-62页 |
| ·间接ELISA检测免疫小鼠的抗体水平 | 第58页 |
| ·IgMμ_真抗原包被最佳浓度与阳性对照血清最佳稀释度的确定 | 第58-59页 |
| ·细胞融合率与阳性率的计算 | 第59页 |
| ·单克隆抗体的筛选与单克隆杂交瘤细胞株的建立 | 第59-60页 |
| ·抗IgMμ_原单克隆抗体细胞株的建立 | 第60页 |
| ·单抗腹水效价的测定和亚型鉴定 | 第60页 |
| ·抗IgMμ_原单克隆抗体与猪、牛及鸡血清中IgM的反应性 | 第60-62页 |
| 3 讨论 | 第62-64页 |
| 全文总结 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-72页 |
| 附录 | 第72-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
