| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 一 前言 | 第9-19页 |
| 1 核酶背景简介 | 第9-16页 |
| ·RNASE P介绍 | 第10-13页 |
| ·RNase P RNA | 第10-12页 |
| ·RNase P protein | 第12-13页 |
| ·RNASE P作用底物共同的结构特征 | 第13-15页 |
| ·金属阳离子对RNASE P作用的影响 | 第15页 |
| ·EGS及M1GS的提出 | 第15-16页 |
| 2 HCMV简介 | 第16-18页 |
| ·病毒学特征及危害 | 第16-17页 |
| ·磷酸转移酶UL97基因介绍 | 第17-18页 |
| 3 课题意义 | 第18-19页 |
| 二 技术路线 | 第19-20页 |
| 三 实验仪器与材料 | 第20-23页 |
| 1 主要仪器 | 第20页 |
| 2 实验材料 | 第20-23页 |
| ·质粒和菌种 | 第20-21页 |
| ·寡核苷酸片段 | 第21页 |
| ·主要试剂 | 第21页 |
| ·其它主要试剂的配方 | 第21-23页 |
| 四 实验方法 | 第23-40页 |
| 1 HCMV UL97基因的克隆 | 第23-27页 |
| ·引物设计 | 第23页 |
| ·PCR扩增 | 第23-24页 |
| ·UL97基因目的片段与PGEM-3Z质粒载体的双酶切、去磷酸化 | 第24-26页 |
| ·UL97基因目的片段与PGEM-3Z质粒载体的连接 | 第26页 |
| ·UL97亚克隆质粒的转化、筛选、鉴定和大量制备 | 第26-27页 |
| 2 GS设计 | 第27-28页 |
| ·理论高引导活性GS设计要求 | 第27-28页 |
| ·UL97基因中符合GS设计要求的位点 | 第28页 |
| 3 M1GS的突变、克隆及其相应底物片段的选择和克隆 | 第28-34页 |
| ·M1GS的突变及克隆 | 第28-30页 |
| ·其余7个M1GS的克隆 | 第30-32页 |
| ·M1GS T3(NO BRIDGE)的克隆 | 第32-33页 |
| ·GS所在位置相应底物片段的选择和克隆 | 第33-34页 |
| 4 M1GS及底物DNA片段(转录模板)的制备 | 第34-36页 |
| ·M1GS DNA模板的制备 | 第34-35页 |
| ·M1GS亚克隆质粒的Hind Ⅲ酶切 | 第34页 |
| ·M1GS亚克隆质粒Hind Ⅲ酶切后片段的末端平滑处理 | 第34-35页 |
| ·底物DNA片段转录模板的制备 | 第35页 |
| ·RNA MARKER的制备 | 第35-36页 |
| 5 M1GS及其底物片段的体外转录、体外切割和电泳验证 | 第36-40页 |
| ·M1GS的体外转录 | 第36页 |
| ·底物的体外转录 | 第36-37页 |
| ·M1GS及底物转录模板的检验 | 第37-38页 |
| ·体外切割与电泳检测 | 第38-40页 |
| 五 结果与分析 | 第40-56页 |
| 1 HCMV磷酸转移酶UL97基因的克隆与鉴定 | 第40-41页 |
| ·PU97质粒的构建 | 第40-41页 |
| ·PU97质粒的鉴定 | 第41页 |
| 2 M1GS的突变、克隆及鉴定 | 第41-45页 |
| ·M1GS的突变及克隆 | 第41-42页 |
| ·突变后M1GS克隆质粒的鉴定 | 第42-43页 |
| ·其余7个M1GS的克隆与鉴定 | 第43-44页 |
| ·M1GS T3(NO BRIDGE)的克隆与鉴定 | 第44-45页 |
| 3 PU97-D2质粒的构建与鉴定 | 第45-47页 |
| ·PU97-D2质粒的构建 | 第45-46页 |
| ·PU97-D2亚克隆质粒的鉴定 | 第46-47页 |
| 4 M1GS及底物DNA片段(转录模板)的制备 | 第47-49页 |
| ·M1GS转录模板的制备 | 第47-48页 |
| ·M1GS T3(NO BRIDGE)转录模板的制备 | 第48页 |
| ·底物DNA片段转录模板的制备 | 第48-49页 |
| 5 M1GS及其底物片段的体外转录 | 第49-51页 |
| ·M1GS的体外转录 | 第49-50页 |
| ·M1GS T3及M1GS T3(NO BRIDGE)的体外转录 | 第50页 |
| ·底物片段的体外转录 | 第50-51页 |
| 6 人工核酶MIGS对底物的体外切割 | 第51-56页 |
| ·体外切割产物的理论预计 | 第51页 |
| ·核酶与底物的体外切割产物电泳检测结果 | 第51-56页 |
| ·M1GS C1、C2及M1GST1～T6对D1、D2底物的体外切割产物电泳结果 | 第51-53页 |
| ·M1GS T3(非CCA末端)对D2片段的体外切割产物电泳结果 | 第53-54页 |
| ·M1GS T3(no bridge)对D2片段的体外切割产物电泳结果 | 第54-56页 |
| 六 讨论 | 第56-65页 |
| 1 大肠杆菌来源RNASE P的催化反应机理 | 第56-57页 |
| 2 大肠杆菌来源RNASE P催化亚单位M1 RNA的体外切割活性影响因素 | 第57-65页 |
| ·底物片段 | 第57-59页 |
| ·金属阳离子 | 第59-61页 |
| ·底物与核酶的比例 | 第61页 |
| ·CCA末端必要性 | 第61页 |
| ·连接序列BRIDGE的重要性 | 第61-65页 |
| 七 小结 | 第65-66页 |
| 八 附录 | 第66-74页 |
| 附录1 UL97基因全长测序结果(序列) | 第66-70页 |
| 附录2 GENEBANK公布UL97基因全序列 | 第70-72页 |
| 附录3 M1GS T3克隆质粒测序结果 | 第72-73页 |
| 附录4 PFL117质粒测序结果 | 第73-74页 |
| 九 参考文献 | 第74-77页 |
| 十 致谢 | 第77页 |
