| 摘要 | 第3-7页 |
| ABSTRACT | 第7-11页 |
| 第一章 研究背景和文献综述 | 第19-74页 |
| 1.1 乳腺发育和乳腺癌概述 | 第19-48页 |
| 1.1.1 乳腺发育的研究 | 第19-22页 |
| 1.1.1.1 小鼠乳腺发育过程 | 第19-21页 |
| 1.1.1.2 小鼠乳腺结构 | 第21-22页 |
| 1.1.2 乳腺干细胞 | 第22-42页 |
| 1.1.2.1 小鼠乳腺干细胞的识别和研究手段 | 第23-25页 |
| 1.1.2.2 乳腺干细胞的研究方法 | 第25-30页 |
| 1.1.2.3 人的乳腺干细胞的研究进展 | 第30页 |
| 1.1.2.4 乳腺干细胞的微环境 | 第30-31页 |
| 1.1.2.5 乳腺干细胞的分子调控机制 | 第31-42页 |
| 1.1.3 乳腺癌和乳腺癌干细胞 | 第42-48页 |
| 1.1.3.1 人类乳腺癌的分子亚型 | 第42-43页 |
| 1.1.3.2 研究乳腺癌的小鼠模型 | 第43-48页 |
| 1.2 肿瘤血管生成的简介 | 第48-53页 |
| 1.2.1 肿瘤内血管生成特点 | 第48-50页 |
| 1.2.2 肿瘤血管新生的调控因子 | 第50-53页 |
| 1.2.2.1 促进血管新生的调控因子 | 第50-51页 |
| 1.2.2.2 抑制血管新生的调控因子 | 第51-52页 |
| 1.2.2.3 细胞间粘附分子 | 第52页 |
| 1.2.2.4 基质金属蛋白酶(MMPs) | 第52-53页 |
| 1.2.2.5 其他参与肿瘤血管生成的重要因子 | 第53页 |
| 1.3 G蛋白偶联受体概述 | 第53-73页 |
| 1.3.1 G蛋白偶联受体48(Gpr48)概述 | 第59-66页 |
| 1.3.2 G蛋白偶联受体54 (GPR54)概述 | 第66-71页 |
| 1.3.3 G蛋白偶联受体124(GPR124)概述 | 第71-73页 |
| 1.4 研究目的 | 第73-74页 |
| 第二章 GPR48/LGR4及其信号传导在乳腺发育及其乳腺干细胞和乳腺癌中的作用 | 第74-133页 |
| 2.1 前言 | 第74页 |
| 2.2 基本的实验材料和方法 | 第74-91页 |
| 2.2.1 材料 | 第74-76页 |
| 2.2.2 实验方法 | 第76-91页 |
| 2.2.2.1 小鼠基因型鉴定和小鼠表型分析方法 | 第76-79页 |
| 2.2.2.2 乳腺组织的整体染色 | 第79-80页 |
| 2.2.2.3 乳腺组织和乳腺肿瘤组织的包埋和切片 | 第80页 |
| 2.2.2.4 免疫组织化学抗体染色 | 第80-81页 |
| 2.2.2.5 免疫荧光染色 | 第81-82页 |
| 2.2.2.6 BrdU掺入法 | 第82页 |
| 2.2.2.7 乳腺上皮细胞的分离 | 第82-83页 |
| 2.2.2.8 原代乳腺组织体(primary mammary organoids)的分离 | 第83页 |
| 2.2.2.9 乳腺球形成实验及其自我更新传代检测 | 第83-84页 |
| 2.2.2.10 即乳腺组织体(mammary organoids)形成实验 | 第84页 |
| 2.2.2.11 体外集落/克隆分析实验(in vitro colony assay) | 第84页 |
| 2.2.2.11 限制性稀释移植实验 | 第84-85页 |
| 2.2.2.12 乳腺干细胞的流式细胞分选 | 第85页 |
| 2.2.2.13 总RNA的提取和rt-PCR | 第85-86页 |
| 2.2.2.14 半定量RT-PCR分析 | 第86页 |
| 2.2.2.15 染色质免疫沉淀分析(ChIP) | 第86-87页 |
| 2.2.2.16 慢病毒的制备和感染 | 第87-88页 |
| 2.2.2.17 细胞的培养 | 第88-89页 |
| 2.2.2.18 细胞转染和荧光素酶分析 | 第89-90页 |
| 2.2.2.19 细胞迁移和侵入实验 | 第90-91页 |
| 2.2.2.20 统计分析 | 第91页 |
| 2.3 结果 | 第91-130页 |
| 2.3.1 Gpr48在调控乳腺发育和乳腺干细胞中的功能研究 | 第91-119页 |
| 2.3.1.1 Gpr48敲除小鼠的建立(实验室建立) | 第91-93页 |
| 2.3.1.2 Gpr48在乳腺组织中的表达情况 | 第93-94页 |
| 2.3.1.3 Gpr48~(-/-)小鼠乳腺发育迟缓且异常 | 第94-98页 |
| 2.3.1.4 Gpr48调节上皮细胞中雌激素受体α(ERα)和孕激素受体(PR)的表达水平 | 第98-100页 |
| 2.3.1.5 Gpr48~(-/-)抑制乳腺上皮细胞增殖和促进其凋亡 | 第100-102页 |
| 2.3.1.6 Gpr48~(-/-)对乳腺基底/肌上皮细胞的生长的影响 | 第102-103页 |
| 2.3.1.7 Gpr48~(-/-)对乳腺上皮细胞分化的影响 | 第103-104页 |
| 2.3.1.8 Gpr48中乳腺干细胞群MRU细胞群数目减少 | 第104-105页 |
| 2.3.1.9 体外分析Gpr48对乳腺干细胞的自我更新能力的调控 | 第105-106页 |
| 2.3.1.10 体外分析Gpr48对乳腺干细胞的分化能力的调控 | 第106-108页 |
| 2.3.1.11 体内分析Gpr48对乳腺干细胞的调控 | 第108-110页 |
| 2.3.1.12 经典的Wnt信号能够修复Gpr48~(-/-)导致的乳腺组织体形成的缺陷 | 第110-111页 |
| 2.3.1.13 Gpr48调控参与乳腺发育和乳腺干细胞的信号途径 | 第111-115页 |
| 2.3.1.14 Gpr48通过调控Sox2调控乳腺干细胞和乳腺发育 | 第115-117页 |
| 2.3.1.15 Sox2能够修复GPr48~(-/-)导致的乳腺上皮细胞自我更新能力 | 第117-118页 |
| 2.3.1.16 Gpr48调控乳腺发育和乳腺干细胞的信号通路模型图 | 第118-119页 |
| 2.3.2 Gpr48调控乳腺癌的发生发展和转移 | 第119-130页 |
| 2.3.2.1 Gpr48在乳腺癌中的表达情况 | 第119-122页 |
| 2.3.2.2 Gpr48敲除小鼠与MMTV-PyMT乳腺癌小鼠的杂交策略 | 第122-123页 |
| 2.3.2.3 Gpr48的沉默推迟了MMTV-PyMT小鼠乳腺癌的发生发展 | 第123-124页 |
| 2.3.2.4 Gpr48的敲除抑制乳腺癌细胞的增殖 | 第124-125页 |
| 2.3.2.5 Gpr48的单倍剂量不足导致乳腺癌的发生推迟,且乳腺癌的肿瘤数目减少 | 第125-126页 |
| 2.3.2.6 Gpr48的单倍剂量不足导致乳腺癌相关的肺转移推迟 | 第126-127页 |
| 2.3.2.7 乳腺癌细胞系中干扰GPR48导致细胞迁移和侵袭都减弱 | 第127-130页 |
| 2.4 讨论 | 第130-133页 |
| 第三章 GPR54及其信号传导对乳腺癌发生、发展和转移的作用 | 第133-157页 |
| 3.1 前言 | 第133页 |
| 3.2 实验材料和方法 | 第133-139页 |
| 3.2.1 材料 | 第133-136页 |
| 3.2.2 实验方法 | 第136-139页 |
| 3.2.2.1 小鼠基因型鉴定和小鼠表型分析方法 | 第136-137页 |
| 3.2.2.2 原代乳腺肿瘤细胞的分离和培养 | 第137-138页 |
| 3.2.2.3 利用干扰技术进行小鼠肿瘤体内分析 | 第138页 |
| 3.2.2.4 小鼠肿瘤细胞原位移植 | 第138页 |
| 3.2.2.5 检测Rho GTPases活性 | 第138-139页 |
| 3.2.2.6 统计分析 | 第139页 |
| 3.3 结果 | 第139-154页 |
| 3.3.1 PyMT/Gpr54乳腺癌小鼠模型的构建方法及应用原理 | 第139-140页 |
| 3.3.2 Gpr54~(+/-)导致乳腺癌起始、发生、发展和延迟 | 第140-141页 |
| 3.3.3 Gpr54~(+/-)导致乳腺癌转移延迟 | 第141-142页 |
| 3.3.4 Gpr54~(+/-)延迟了乳腺增生和肿瘤形成的发生率 | 第142-143页 |
| 3.3.5 Gpr54~(+/-)影响乳腺癌的恶性程度 | 第143-145页 |
| 3.3.6 Gpr54~(+/-)在肿瘤组织中的表达情况 | 第145页 |
| 3.3.7 自分泌型Kiss1/Gpr54信号足以引发小鼠乳腺肿瘤发生 | 第145-146页 |
| 3.3.8 体外研究Gpr54单倍剂量不足在乳腺癌细胞中影响肿瘤发生 | 第146-148页 |
| 3.3.9 体内研究Gpr54单倍剂量不足在乳腺癌细胞中影响肿瘤发生 | 第148页 |
| 3.3.10 在Ras诱导的肿瘤发生中Gpr54能够激活RhoA | 第148-150页 |
| 3.3.11 在正常乳腺上皮细胞中自分泌的Gpr54信号通过RhoA足以调控Ras诱导的乳腺癌发生 | 第150-151页 |
| 3.3.12 Kisspeptin通过GPR54-Gαq-p63RhoGEF激活RhoA介导的转录调控 | 第151-153页 |
| 3.3.13 Gpr54对乳腺肿瘤组织中受RhoA调控的蛋白水平的表达的影响 | 第153-154页 |
| 3.4 讨论 | 第154-157页 |
| 第四章 GPR124在内皮细胞中VEGF诱导的肿瘤血管发生中的作用 | 第157-179页 |
| 4.1 前言 | 第157页 |
| 4.2 基本的实验材料和方法 | 第157-176页 |
| 4.2.1 材料 | 第157-162页 |
| 4.2.2 实验方法(大部分实验方法于前类似) | 第162-163页 |
| 4.2.2.1 HUVEC和HMEC的培养 | 第162页 |
| 4.2.2.2 细胞和细胞相互作用分析 | 第162页 |
| 4.2.2.3 细胞与整合素相互作用分析 | 第162-163页 |
| 4.2.2.4 体内肿瘤生长实验 | 第163页 |
| 4.2.2.5 Western Blot | 第163页 |
| 4.2.3 结果 | 第163-176页 |
| 4.2.3.1 体内研究GPR124在肿瘤血管发生中的作用 | 第163-166页 |
| 4.2.3.2 体外研究GPR124在肿瘤血管发生中的作用 | 第166-169页 |
| 4.2.3.3 GPR124对血管通透性的调控作用 | 第169-170页 |
| 4.2.3.4 干扰GPR124(GPR124i)能够抑制VEGF诱导激活的VEGFR2/SRC/FAK信号途径 | 第170-171页 |
| 4.2.3.5 GPR124调控参与血管生成的基因的表达 | 第171-174页 |
| 4.2.3.6 GPR124中RGD模体对于VEGF诱导的肿瘤的血管发生十分重要 | 第174-176页 |
| 4.3 讨论 | 第176-179页 |
| 第五章 结语 | 第179-182页 |
| 参考文献 | 第182-205页 |
| 附录一 | 第205-206页 |
| 附录二 | 第206-208页 |
| 致谢 | 第208-210页 |
