| 致谢 | 第14-15页 |
| 英文缩略词 | 第15-17页 |
| 摘要 | 第17-20页 |
| Abstract | 第20-23页 |
| 第一章 文献综述 | 第24-45页 |
| 1.1 细菌胞外多糖的分类、单糖组成及其应用 | 第25-28页 |
| 1.1.1 细菌胞外多糖的分类及其单糖组成 | 第25-26页 |
| 1.1.2 细菌胞外多糖的应用 | 第26-28页 |
| 1.2 细菌胞外多糖的生物合成 | 第28-40页 |
| 1.2.1 细菌EPS胞外合成模式 | 第28页 |
| 1.2.2 细菌EPS胞内合成模式 | 第28-40页 |
| 1.2.2.1 糖底物的吸收 | 第30-32页 |
| 1.2.2.2 糖的胞内代谢及糖核苷酸前体的合成 | 第32-33页 |
| 1.2.2.3 重复单元的组装 | 第33-37页 |
| 1.2.2.3.1 重复单元的组装过程 | 第33-34页 |
| 1.2.2.3.2 重复单元组装的关键酶——糖基转移酶 | 第34-36页 |
| 1.2.2.3.3 重复单元的修饰 | 第36-37页 |
| 1.2.2.4 多糖延伸、聚合及胞外输出 | 第37-40页 |
| 1.2.2.4.1 多糖延伸、聚合不同模式 | 第37-40页 |
| 1.2.2.4.2 EPS的胞外输出 | 第40页 |
| 1.3 细菌胞外多糖的生物合成基因簇研究 | 第40-42页 |
| 1.4 展望 | 第42-43页 |
| 1.5 本工作的研究目的及研究内容 | 第43-45页 |
| 第二章 Paenibacillus elgii B69胞外多糖分离纯化及结构研究 | 第45-76页 |
| 2.1 前言 | 第45页 |
| 2.2 材料 | 第45-47页 |
| 2.2.1 菌株 | 第45-46页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第46页 |
| 2.2.3 培养基的配制 | 第46-47页 |
| 2.2.3.1 LB液体培养基 | 第46页 |
| 2.2.3.2 LB固体培养基 | 第46页 |
| 2.2.3.3 YM液体培养基 | 第46页 |
| 2.2.3.4 YM固体培养基 | 第46页 |
| 2.2.3.5 发酵培养基 | 第46-47页 |
| 2.2.4 主要仪器 | 第47页 |
| 2.3 方法 | 第47-56页 |
| 2.3.1 胞外多糖的发酵 | 第47页 |
| 2.3.2 胞外多糖的提取制备 | 第47页 |
| 2.3.3 粗多糖中蛋白的去除 | 第47-48页 |
| 2.3.3.1 蛋白酶法 | 第48页 |
| 2.3.3.2 Sevag法 | 第48页 |
| 2.3.4 胞外多糖的分离纯化 | 第48-49页 |
| 2.3.4.1 Q-Sepharose Fast Flow柱层析 | 第48页 |
| 2.3.4.2 Sepharose CL-6B柱层析 | 第48-49页 |
| 2.3.5 多糖纯度及分子量测定 | 第49页 |
| 2.3.6 单糖组成及比例分析 | 第49-51页 |
| 2.3.6.1 纯化多糖水解 | 第49页 |
| 2.3.6.2 中性糖组成分析 | 第49-50页 |
| 2.3.6.2.1 PMP衍生化法测定 | 第50页 |
| 2.3.6.2.2 Bio-Rad糖分析柱Aminex HPX-87H测定多糖组成及比例 | 第50页 |
| 2.3.6.3 葡萄糖醛酸含量分析 | 第50-51页 |
| 2.3.6.3.1 相关溶液的配制 | 第50-51页 |
| 2.3.6.3.2 标准曲线的制作 | 第51页 |
| 2.3.6.3.3 样品的测定 | 第51页 |
| 2.3.7 红外光谱测定 | 第51页 |
| 2.3.8 部分酸水解法分析多糖主链与支链 | 第51页 |
| 2.3.9 高碘酸氧化 | 第51-52页 |
| 2.3.9.1 相关溶液的配制 | 第51-52页 |
| 2.3.9.2 标准曲线的制作 | 第52页 |
| 2.3.9.3 样品测定 | 第52页 |
| 2.3.9.4 甲酸测定 | 第52页 |
| 2.3.10 Smith降解 | 第52-53页 |
| 2.3.10.1 多糖还原及水解 | 第52页 |
| 2.3.10.2 HPLC分析水解组成 | 第52-53页 |
| 2.3.11 甲基化及GC-MS分析 | 第53-55页 |
| 2.3.11.1 醛酸还原 | 第53页 |
| 2.3.11.2 甲基化 | 第53-54页 |
| 2.3.11.2.1 试剂的预处理 | 第53页 |
| 2.3.11.2.2 样品的预处理 | 第53-54页 |
| 2.3.11.2.3 甲基亚磺酰甲基钠(SMSM)的制备 | 第54页 |
| 2.3.11.2.4 甲基化反应 | 第54页 |
| 2.3.11.3 全甲基化多糖水解及乙酰化 | 第54页 |
| 2.3.11.4 GC/MS分析 | 第54-55页 |
| 2.3.12 低聚寡糖的制备、分离纯化及质谱分析 | 第55-56页 |
| 2.3.12.1 多糖降解酶的制备 | 第55页 |
| 2.3.12.2 寡糖酶法制备 | 第55页 |
| 2.3.12.3 寡糖的分离制备 | 第55页 |
| 2.3.12.4 寡糖的质谱分析 | 第55-56页 |
| 2.4 结果 | 第56-74页 |
| 2.4.1 多糖脱蛋白 | 第56页 |
| 2.4.2 胞外多糖的分离纯化 | 第56-57页 |
| 2.4.2.1 离子交换柱层析Q-Sepharose Fast Flow分离 | 第56-57页 |
| 2.4.2.2 Sepharose CL-6B柱层析分离 | 第57页 |
| 2.4.3 纯化胞外多糖紫外-可见光谱分析 | 第57-58页 |
| 2.4.4 胞外多糖纯度及分子量测定 | 第58-59页 |
| 2.4.5 单糖组成及比例 | 第59-61页 |
| 2.4.6 红外光谱分析 | 第61-62页 |
| 2.4.7 部分酸水解产物分析 | 第62-63页 |
| 2.4.8 高碘酸氧化和Smith降解 | 第63-66页 |
| 2.4.8.1 高碘酸氧化结果 | 第64-65页 |
| 2.4.8.2 Smith降解结果 | 第65-66页 |
| 2.4.9 甲基化分析 | 第66-72页 |
| 2.4.10 寡糖的ESI-CID-MS/MS分析 | 第72-74页 |
| 2.5 讨论 | 第74-76页 |
| 第三章 UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因功能鉴定 | 第76-111页 |
| 3.1 前言 | 第76-77页 |
| 3.2. 材料 | 第77-82页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第77-78页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第78-79页 |
| 3.2.3 培养基的配制 | 第79-80页 |
| 3.2.3.1 LB液体培养基 | 第79页 |
| 3.2.3.2 LB固体培养基 | 第79页 |
| 3.2.3.3 YM液体培养基 | 第79页 |
| 3.2.3.4 YM固体培养基 | 第79-80页 |
| 3.2.3.5 M9培养基 | 第80页 |
| 3.2.3.6 发酵培养基 | 第80页 |
| 3.2.4 主要仪器 | 第80页 |
| 3.2.5 各类PCR引物 | 第80-81页 |
| 3.2.6 酶蛋白Ni亲和层析试剂的配制 | 第81-82页 |
| 3.3 方法 | 第82-94页 |
| 3.3.1 各类菌株培养方法 | 第82页 |
| 3.3.2 PeUxsl和PeUxs2编码基因的克隆及大肠杆菌原核表达载体构建 | 第82-83页 |
| 3.3.2.1 P. elgii B69基因组DNA的提取 | 第82页 |
| 3.3.2.2 序列的克隆 | 第82-83页 |
| 3.3.2.3 片段割胶回收后测序 | 第83页 |
| 3.3.2.4 原核表达载体构建 | 第83页 |
| 3.3.3 重组酶PeUxs1和PeUxs2的原核表达 | 第83-84页 |
| 3.3.4 UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶酶活测定 | 第84页 |
| 3.3.5 高效液相检测 | 第84-85页 |
| 3.3.6 Real-Time~1H NMR测定检测是否存在中间产物 | 第85页 |
| 3.3.7 重组蛋白动力学分析 | 第85-86页 |
| 3.3.8 基于胸腺嘧啶营养缺陷型筛选标记的基因敲除载体pLOT的构建 | 第86-87页 |
| 3.3.9 单基因突变菌株TM01(△Peuxs1)、TM02(△Peuxs2)及双基因突变菌株TM03(△Peuxs1△Peuxs2)的构建 | 第87-93页 |
| 3.3.9.1 营养缺陷型菌株的筛选 | 第87-88页 |
| 3.3.9.2 含目的基因上下游同源序列的敲除载体pLOT-uxs1和pLOT-uxs2的构建 | 第88-89页 |
| 3.3.9.2.1 PCR扩增Peuxs1和Peuxs2基因上下游片段 | 第88页 |
| 3.3.9.2.2 质粒pLOT及基因上下游同源序列酶切及连接 | 第88页 |
| 3.3.9.2.3 pLOT-uxs1和pLOT-uxs2质粒转化大肠杆菌S17-1 | 第88-89页 |
| 3.3.9.3 单基因突变及双基因突变重组菌株的构建 | 第89-93页 |
| 3.3.9.3.1 三亲接合 | 第89-90页 |
| 3.3.9.3.2 第一次交换重组子的筛选 | 第90-93页 |
| 3.3.9.3.3 第二轮单交换重组子的筛选 | 第93页 |
| 3.3.9.3.4 双基因敲除菌株的构建 | 第93页 |
| 3.3.10 无细胞提取物的制备测定各菌株的UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶活性 | 第93-94页 |
| 3.3.11 胞内糖核苷酸含量测定 | 第94页 |
| 3.3.12 胞外多糖产量及其单糖组分及比例分析 | 第94页 |
| 3.4 结果 | 第94-107页 |
| 3.4.1 P. elgii B69 UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶1(PeUxs1)和UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶2(PeUxs2)基因的确定及克隆鉴定 | 第94-96页 |
| 3.4.2 Peuxs1和Peuxs2异源表达及酶活测定 | 第96-99页 |
| 3.4.3 Real-time~1H NMR分析PeUxs1和PeUxs2酶活 | 第99-101页 |
| 3.4.4 PeUxs1和PeUxs2生化活性分析 | 第101-103页 |
| 3.4.5 营养缺陷型菌株筛选及基因敲除菌株的构建 | 第103-106页 |
| 3.4.6 突变菌株胞内糖核苷酸水平的变化及对胞外多糖产量和单糖组成的影响 | 第106-107页 |
| 3.5 讨论 | 第107-111页 |
| 第四章 P.elgii B69 EPS生物合成途径相关糖基转移酶功能研究 | 第111-142页 |
| 4.1 前言 | 第111-112页 |
| 4.2 材料 | 第112-118页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第112-113页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第113-114页 |
| 4.2.3 培养基的配制 | 第114-115页 |
| 4.2.3.1 LB液体培养基 | 第114页 |
| 4.2.3.2 LB固体培养基 | 第114页 |
| 4.2.3.3 YM液体培养基 | 第114页 |
| 4.2.3.4 YM固体培养基 | 第114-115页 |
| 4.2.3.5 M9培养基 | 第115页 |
| 4.2.3.6 P. elgii发酵培养基 | 第115页 |
| 4.2.4.7 S.elodea发酵培养基 | 第115页 |
| 4.2.4 主要仪器 | 第115-116页 |
| 4.2.5 各类PCR引物 | 第116-118页 |
| 4.2.6 酶蛋白Ni亲和层析试剂的配制 | 第118页 |
| 4.3 方法 | 第118-126页 |
| 4.3.1 各类菌株培养方法 | 第119页 |
| 4.3.2 糖基转移酶相关序列比对分析 | 第119页 |
| 4.3.3 糖基转移酶编码基因敲除突变菌株的构建 | 第119-121页 |
| 4.3.3.1 P. elgii B69基因组DNA的提取 | 第119页 |
| 4.3.3.2 含靶基因上下游同源序列的敲除载体的构建 | 第119-121页 |
| 4.3.3.2.1 PCR扩增各糖基转移酶基因上下游片段 | 第119-120页 |
| 4.3.3.2.2 各糖基转移酶基因上下游同源序列的重叠PCR连接 | 第120页 |
| 4.3.3.2.3 连接产物与敲除载体pLOT In-fusion连接 | 第120-121页 |
| 4.3.3.2.4 敲除质粒转化大肠杆菌S17-1 | 第121页 |
| 4.3.3.3 各糖基转移酶突变重组菌株的构建 | 第121页 |
| 4.3.4 S.elodea引导糖基转移酶的敲除及回补实验 | 第121-123页 |
| 4.3.4.1 S.elodea引导糖基转移酶的敲除 | 第122页 |
| 4.3.4.2 P.elgii GT_p基因回补S.elodea(△gelB) | 第122-123页 |
| 4.3.5 糖基转移酶基因原核表达载体的构建 | 第123页 |
| 4.3.5.1 序列的克隆 | 第123页 |
| 4.3.5.2 扩增片段割胶回收后测序 | 第123页 |
| 4.3.5.3 原核表达载体构建 | 第123页 |
| 4.3.6 重组酶的原核表达及纯化 | 第123-124页 |
| 4.3.7 酶活反应细胞膜提取物的制备 | 第124页 |
| 4.3.8 体外酶活反应测定 | 第124-125页 |
| 4.3.8.1 引导糖基转移酶酶活测定 | 第124-125页 |
| 4.3.8.2 其他糖基转移酶活性测定 | 第125页 |
| 4.3.9 胞外多糖产量及其单糖组分及比例分析 | 第125-126页 |
| 4.4 结果 | 第126-137页 |
| 4.4.1 糖基转移酶序列分析结果 | 第126-127页 |
| 4.4.2 基因敲除菌株表型的变化 | 第127-129页 |
| 4.4.3 GT_p对gelB敲除菌株功能的回补验证 | 第129-130页 |
| 4.4.4 GT_p胞外酶活测定 | 第130-132页 |
| 4.4.5 GT_5功能的确定——葡萄糖醛酸转移酶 | 第132-134页 |
| 4.4.6 GT_4功能的确定——葡萄糖(Ⅱ)转移酶 | 第134-135页 |
| 4.4.7 GT_3、GT_2、GT_1功能的确定——分别为甘露糖转移酶、木糖(Ⅰ)转移酶、及木糖(Ⅱ、支链)转移酶 | 第135-137页 |
| 4.5 讨论 | 第137-142页 |
| 第五章 P.elgii B69胞外多糖生物合成基因簇中其他基因的生物信息学研究 | 第142-154页 |
| 5.1 前言 | 第142-143页 |
| 5.2 材料 | 第143页 |
| 5.3 方法 | 第143-144页 |
| 5.4 结果 | 第144-151页 |
| 5.4.1 糖基转移酶序列分析结果 | 第144-146页 |
| 5.4.2 与核苷糖前体活化有关的基因 | 第146-147页 |
| 5.4.3 重复单元合成相关基因——糖基转移酶基因 | 第147-148页 |
| 5.4.4 与多糖的聚合及分泌有关的基因 | 第148-150页 |
| 5.4.5 pel基因簇中其他功能的基因 | 第150-151页 |
| 5.5 讨论 | 第151-154页 |
| 第六章 全文总结、后续工作建议、在读期间发表的SCI论文与申报的专利 | 第154-161页 |
| 6.1 全文总结 | 第154-157页 |
| 6.2 本文创新点 | 第157页 |
| 6.3 后续工作建议 | 第157页 |
| 6.4 在读期间发表的SCI论文与申报的专利 | 第157-161页 |
| 参考文献 | 第161-181页 |
